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1、单克隆抗体的制备及其应用研究进展燕珊珊摘要:单克隆抗体技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。此外， 抗体还可能执行除目前所具有之外的更多功能。本文将就单克隆抗体的制备及其应用研究进展进行论述。关键词: 单克隆抗体；基因工程；小鼠骨髓瘤细胞；细胞杂交瘤技术；噬菌体；临床应用抗体是机体免疫系统的重要效应分子，从第一代多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb） 到第二代单克隆抗体的成功制备，人们投入了大量的临床应用研究，对医学和生物学的发展发挥了巨大的作用。单克隆抗体（monoclonal antibod
2、ies，mAbs）技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。目前，制备mAbs 的方法中比较成熟的主要有以下几种：1. 抗原特异性的B 淋巴细胞杂交瘤技术；2. 人-鼠嵌合抗体制备技术； 3.噬菌体展示技术获得的抗原特异性人源性抗体；4. 转基因小鼠制备的人mAbs；5.核糖体展示技术。通过这些方法，我们利用相应抗原靶向构建治疗性抗体，从而达到预防、治疗疾病的目的，促进生物制药学的发展。以下主要是对抗体制备技术的发展及其应用研究进展进行综述。1 鼠源性抗体1975 年，Kohler 和Milstein1 将小鼠骨髓瘤细胞
3、和经绵阳红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。由免疫B细胞-浆细胞、瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系可分泌单一、特异性、纯化的抗体，且能在选择培养基中生长、无限增值、分裂，同时在选择培养基作用下，利用代谢缺陷补救机理筛选出同时具有两种细胞特征的细胞克隆。这种经过反复克隆而挑选出来的融合细胞所产生的抗体称为单克隆抗体(McAb)。它在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。至今，
4、科学家们已经建立众多鼠源性mAbs 来诊断和治疗多种人类疾病。然而作为在人体内的应用， 鼠源单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody,HAMA）2，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs 不能与人类抗体FcRn 结合3。为了克服以上这些问题，近年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。2 人-鼠嵌合抗体嵌合抗体指的是鼠mAbs 的恒定区基因被人Abs 的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体4-5。这样既能保持鼠
5、单抗的特性， 又使获得的单抗降低了在人体内的免疫反应。Jones6等在20 世纪80 年代中期首次成功构建了小鼠抗半抗原-4-羟基-3-硝基苯乙酰基己酸(NP)的免疫球蛋白VH 基因， 并最终获得可特异结合NP的人源化嵌合抗体， 再通过定点突变法进行单纯的CDR 移植构建，形成第一代人源化抗体。随后还相继研发了阿昔单抗（抗GPIIb-IIIa鼠-人嵌合抗体）、美罗华(Rit-uximab)、Cetuximab(C225，Erbitux)、Zevalin 和Bexxa 等嵌合抗体，现均已被广泛应用于科学研究与疾病诊断之中。CDR 移植抗体，又称改型抗体，它是在嵌合抗体的基础上，利用基因工程技术，
6、进一步用人的FR 代替鼠FR，形成的只剩3 个鼠源CDR 的、更为完全的人源化抗体。由于具有支持作用的FR 不仅为CDR 的构想提供了环境，还参与抗体结合位点正确构像的形成和抗原的结合，常常使得CDR 移植抗体的亲和力和特异性大大降低，有的甚至还丧失了抗原结合能力7。通过大量研究，我们发现选用与鼠源单抗具有高度同源性的人源抗体， 但保留鼠源单抗中的一些关键氨基酸残基，并在此基础上，对鼠CDR 和FR 的一些表面氨基酸残基进行修饰或重塑，对关键氨基酸残基进行一定的改变，能在保留CDR 移植抗体的亲和力和特异性下，大大降低其免疫原性。因此，相对于嵌合抗体，第二代人源化抗体-CDR 移植抗体的人源化
7、程度能达到70%以上， 有利于其在临床试验中的应用与研究。3 完全人源性抗体为了能使单克隆抗体大量的应用于疾病治疗、临床试验和科研中，我们不仅要降低其免疫原性，还要对其亲和力质量、治疗能力强弱等方面提更高的要求。目前，研究人员已建立多种方法生产完全人源性抗体，主要有噬菌体展示技术和转基因小鼠技术。3.1 噬菌体展示技术1985 年，Smith G P8将外源基因通过基因工程技术插入丝状噬菌体基因组中，从而在噬菌体表面以融合蛋白的形式展示，这一技术即为噬菌体展示技术。该技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来，从而得到全套的噬菌体库。近年来该技术在众多基
8、础和应用研究领域如免疫学、细胞生物学、药物开发中产生的影响已日渐明显。噬菌体展示首先是通过大肠杆菌特异性的噬菌体发展起来。迄今为止， 已建立的噬菌体展示系统，如：丝状噬菌体、l 噬菌体、T4噬菌体、T7 噬菌体和真核病毒系统等。此外多肽还被展示在细菌及酵母的表面。虽然这些不同展示系统的优点在特殊应用中得到了证明，但都是基于丝状噬菌体M13 和噬菌粒相互作用之上。噬菌体展示的基本原理是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因通过基因工程技术随机插入噬菌体的外壳蛋白基因，继而感染大肠杆菌，经增殖并以抗体片段Fab 或ScFv9外壳蛋白融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；利用靶分子，经过“亲和-
9、洗脱-扩增-亲和”循环过程筛选，除去杂蛋白并富集特异性抗体10。在噬菌体表面所展示的是随机肽段或蛋白质的抗体库称为全套抗体库， 从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体， 它的最大特点是实现了直接将基因型和表型完美的结合在一起， 可以快速而高效地从大量克隆筛选出表达特异性的抗体。其中美国Scripps 研究所Lerner 实验室在1989年首次应用噬菌体表面展示技术构建了噬菌体抗体库11。至今，由这一技术产生的抗体至少有14 个已用于临床试验中5,12。然而，它还存在着如未经免疫获得的抗体亲和力相对较弱， 抗体库的库容无法涵盖一些动物的抗体多样性等缺点，因此，大容量抗体库的亲和力和抗体多样性问题将是我们
10、今后研究抗体库技术所必须考虑的关键。3.2 转基因小鼠技术自1994 年Lonberg 等13建立了表达人免疫球蛋白(Ig)的转基因小鼠以来，人源性抗体便可由动物制备。该技术是将人抗体基因微位点转入小鼠体内， 产生能分泌人抗体的转基因小鼠14。到1998 年，Green 等15将人抗体轻重链基因构建成酵母人工染色体（yeastartificial chromosome,YAC），通过基因打靶技术将其转入自身抗体基因位点已被灭活的小鼠基因组中，通过繁殖筛选，建立分泌高亲和力人抗体的小鼠品系，Mendez 等16采用细胞融合法， 将YAC 的酵母细胞与鼠胚干细胞（ES）融合，将整合有目的基因的ES
11、 细胞导入小鼠囊胚，形成嵌合体小鼠，通过反复筛选，最后获得分泌完全人抗体的转基因小鼠。再用传统的杂交瘤技术，将产生人抗体转基因鼠的B 细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞系，产生高亲和力的人源抗体。由转基因小鼠产生的单克隆抗体，是由多个同源V 基因片段编码而成的，因此在很大的程度上，此抗体的活性能够大大的增强。至目前为止，大约有33 个是由转基因小鼠制备而来的抗体已投于临床实验中17。虽然如此，但是该技术至今还未发展完全，其转基因片段较小，且相邻基因片段高度同源，重组过程复杂，在面对抗原多样性时，无法完全产生相应的抗体。随着免疫学技术和分子生物学等的发展，将会有越来越多的人源性抗体用于临床试验
12、之中，从而促进靶向药物治疗的发展。 3.3 核糖体展示技术核糖体展示是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的有力工具。Mattheakis 等人在1994 年建立了体外核糖体展示随机肽系统，利用“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物在体外将基因型和表型联系起来。随后Hanes和Plukthun 等18在此基础上对该技术加以完善和改良， 正式建立了这种体外筛选技术。该技术的基本原理是利用PCR 扩增含目的基因的cDNA 文库，再加上启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译偶联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，用相应抗原对反复筛选复合物，分离mRNA，通过RT-PCR 富集目
13、的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。核糖体展示技术与噬菌体展示技术和转基因技术相比，由于其完全属于体外操作系统， 无需依赖细胞技术和毒性蛋白对宿主生长的影响，不受体内环境的限制，扩大了展示文库的库容量和分子多样性。此外， 核糖体展示技术无需进行体内外系统转化， 全程只需通过PCR 技术复制、扩增，使得其建库时间缩短，筛选简便。PCR 技术还可引入突变， 增加分子多样性， 从而获得高亲和力抗体。目前还有多研究表明，核糖体展示技术还能提高小分子抗体的稳定性， 如三结构域抗体(VHK)可以明显改进ScFv 的稳定性19。而核糖体展示技术的最大缺
14、点就是mRNA 易降解。目前已有研究表明，氧钒核糖核苷复合物(VRC)作为过渡阶段的类似物发生作用，可有效地抑制核酸酶，提高mRNA 的稳定性。另外“蛋白质-核糖体-mRNA” 三元复合物的稳定性也较差，但可通过在缓冲液中加入一定浓度的镁离子、交联核糖体RNA 的磷酸基团，抑制核糖体复合物的解离20。4 重组抗体的临床应用及其最新进展从鼠源单抗开始， 已通过多种技术制备了具有高度亲和性的完全人源化抗体， 作为靶向治疗多种疾病的新型药物。其中由杂交瘤技术制备的单克隆抗体不仅结果均一、纯度高、特异性强、血清交叉反应弱，而且制备成本低， 而基因工程抗体既保持单抗的均一性、特异性强等优点，又能克服其为
15、鼠源性的不足，因此，拓展mAbs 的广泛应用，是研究开发治疗性抗体药物最理想的途径。近三十年来， 在基因工程抗体方面的研究成果振兴了整个生物制药行业。目前， 全球约有500多种治疗性药物正处于临床前研究，100 多种已处于临床试验中。其中，已被FDA 批准的有治疗淋巴瘤的Rituximab，治疗乳腺癌的Herceptin 21， 以及抗肿瘤坏死因子的嵌合mAb （infliximAb） 对克隆病(Crohns disease,CD)等自生免疫性疾病方面的治疗应用。另外， 还有一些抗体药物在抑制器官移植术后排斥反应和病毒感染性疾病等方面也显示了较好的应用前景。此外， 抗体还可能执行除目前所具有之
16、外的更多功能。如Yamazaki 等近年来新研究出的等位基因特异的抗-HLA 单克隆抗体（ASHmAb）， 可用于干细胞移植的组织相容性抗原分型的临床诊断22。抗体疗法是一门动态学科，它随着技术的成熟而得到发展。但是目前技术还不成熟。据报道，曾有6 个健康志愿者在英国因参加关于CD28 靶向mAb、TGN1412 的一期临床试验， 而被送往深切治疗部2。因此，虽然靶向抗体药物疗法的基本原理早在10 年以前就已被提出，但是它离实际的临床应用尚有距离。目前，该方法还在不断的发展和完善， 主要的目标是能在兼顾亲和力和免疫活性的同时，降低抗体的异原性，从而建立更好的抗体疗法。而据多方实验表明， 抗体疗法的主要障碍在于全人源性抗体的生产和抗体药物的靶向作用问题。生物多价体Fv 作为生产新型免疫分子的模板，以及体内抗体靶向治疗问题（如
