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1、窗体顶端窗体底端基因组工程学里的三大利器 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas在过去，如果你想在模式生物中进行复杂的基因组修饰，你几乎只能选择小鼠。首先，你要设计一个打靶载体，将其引入小鼠胚胎干细胞，并将这些经过修饰的细胞注射到小鼠囊胚。接着是孕育、出生、筛选，等待所需的幼崽成长到性成熟，交配和杂交，之后是更多孕育、更多筛选，一直下去。复杂的项目也许需要一年或更长时间才能完成。它几乎只对小鼠起作用。原因还不是很清楚，也许小鼠胚胎干细胞有着特别活跃的同源重组系统。大鼠和人类则不是这样。不过好消息是，最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令
2、人难以置信的速度。大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由细胞进行修复。区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALEN）这两种新型的核酸酶重新定义了传统生物学研究的界限和范畴。这两种核酸酶都是嵌合体，都是由经过设计的、序列特异性的DNA结合元件（programmable, sequence-specific DNA-binding modules）和非特异性的DNA切割结构域结合而成
3、的。ZFN和TALEN都可以对DNA进行 各种遗传修饰，这两种核酸酶的作用机制都是先对DNA双链分子进行切割，形成DNA双链断裂切口（DNA double-strand break），然后激活细胞内的非同源末端连接修复 机制（nonhomologous end joining，这是一种非保真的、容易出现遗传突变的修复机制），或者同源重组修复机制（homology-directed repair，这是一种高保真的修复机 制，不容易出现突变），利用细胞自身的修复机制对DNA进行遗传学修饰。接下来， 我们就将为读者介绍这种新型的、序列特异性的核酸酶，看看它们在遗传分析和遗传 改造工作中都能发挥哪些功
4、用。此外，我们还会重点介绍ZFN和TALEN在临床治疗方面的潜力，以及这些核酸酶，与包括最新出现的RNA介导的、基于成簇的规律间隔的 短回文重复序列和Cas蛋白的DNA核酸内切酶（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases）在内的 其它核酸酶在未来的发展潜力。 了解基因功能的传统方法和现代方法 随着全基因组测序技术（whole-genome sequencing）的不断发展和完善，以及大型基因组注释项目（genome annot
5、ation projects）的实施，科研人员们已经开始跃跃欲试，想要将基因组研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗 （personalized medicine）工作当中。不过海量的基因组信息也给科研人员们出了一个不小的难题，那就是该如何将这些枯燥的数据转换成有意义的基因组功能，或者与临 床相关的信息呢？解决这个问题的核心就在于尽快开发出一种高效率的、可靠的方法，来帮助科研人员研究基因型（genotype）对表型 （phenotype）的影响作用。利用同源重组机制（homologous recombination）对基因进行定向失活（Targeted gene inac
6、tivation）就是这样一种好方法，可以帮助科研人员明确基因的功能。不过在实际工作中使用这种方法也会受到好几个因素，比如存在效率太低、 费时费力、而且有可能导致突变等的限制。而 RNAi（详见名词解释）等基因靶向敲除技术则为科学家们提供了一种快捷、廉价而且可以开展高通量研究的新方法。不过RNAi这种基因敲除技术的敲除效果 还不够彻底，每次试验以及每个实验室的试验结果都会有差异，另外还存在不可预知的脱靶情况（off-target effect），所以只能够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中。这些研究手段的种种不足都严重限制了科学家们在探索基因型和表型关系的科研道路上前进的 步伐，也妨碍了RNA
7、i技术的实际应用。 近十年来出现了一种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术 （genome editing）”，而前面介绍过的由序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA切割结构域组合而成的人工核酸酶就是这种基因组编辑技术的重要组成 部分。这些嵌合式的核酸酶能够以极高的效率、极高的精确度对基因组进行人工修饰，其机制就是我们前面介绍过的切割DNA产生DSB，然后利用NHEJ或 HDR等 DSB修复机制完成我们所需要的各种人工修饰。由于科研人员们对锌指蛋白和TALE蛋白等蛋白的DNA结合结构域的设计能力越来越
8、强，所以这种基因组编辑 技术的应用范围也一再地被拓展。这些既简单又灵活的核酸酶在遗传工程学领域里发挥了极大的作用，其重要性也在与日俱增，已经站到了遗传工程工作的最前线。 下面我们将介绍几个最近在位点特异性核酸酶技术（site-specific nuclease technologies）领域取得的最新研究成果，我们也将就这项新技术在基因组靶向工程学（targeted genome engineering）领域的应用，以及在对真核细胞和模式生物的分析工作中的应用价值展开探讨。我们还将介绍这种位点特异性核酸酶技术在临床治疗方面 的应用潜力，以及未来的发展趋势，比如RNA介导的、基于成簇的规律间隔的
9、短回文重复序列和 Cas蛋白的DNA核酸内切酶未来的发展和应用前景等。 名词解释： CRISPR/Cas (CRISPR associated) systems： CRISPR/Cas系统（CRISPR相关系统）， CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat）即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌（archaea）胞内起到了一种获得性免疫（acquired immunity）的作用。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA进
10、行序列特异性降解。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中在2型系统（type II systems）中依赖的是Cas9蛋白。在RNA的介导下，Cas9蛋白能够对crRNAtracrRNA识别的靶序列进行切割。 crRNA：CRISPR RNA能够与tracrRNA配对，形成双链RNA结构，这种双链RNA分子能够介导Cas9核酸内切酶对与双链RNA分子互补结合的DNA序列进行切割。 DSB：ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas9系统对 DNA双链进行切割之后就会形成DNA双链断裂缺口（double-strand breaks），即DSB。 HDR：同源重组修复，DSB出现之后，细
11、胞会启动这种修复机制，以同源链为模板，对DSB进行修复。由于这种修复作用是以同源链为模板，而且还有位点特异性的核酸酶（site-specific nuclease）参与，所以其保真度非常高。利用HDR可以插入一个或者多个基因，也可以进行单碱基替换。 NHEJ：非同源末端连接修复机制是另外一种DSB修复机制，通过这种修复可以将断裂的DSB末端直接连接起来。由于在这种修复过程中不会用到同源模板链，所以在断裂处容易出现小的插入或者缺失突变，常常会导致移码突变，使基因的功能遭到破坏。 PAM：前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif），这是一种见于crRNA分子的短核苷
12、酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割。 RNAi：RNA干扰技术，是一种利用RNA分子抑制或者敲除基因表达的技术。从更广义的角度来说，RNA干扰技术是细胞对外源RNA分子的天然抑制机制，是细胞的一种自我保护行为。 TALEN：转录激活因子样效应因子核酸酶主要由 Fok I内切酶结构域和TALE蛋白的DNA结合结构域组合而成。TALE蛋白含有多个33-35个氨基酸组成的重复肽段，而每一个肽段都能够识别一个碱基。与ZFN一样，TALEN也能使DNA靶序列断裂，形成DSB，进而激活DNA损伤修复机制，对基因组进行定点改造。 tracrRNA：反式激活嵌合RNA（trans-activating
13、 chimeric RNA），这是一种非编码RNA，能够促进 crRNA的形成，也是Cas9蛋白发挥RNA介导的DNA切割作用必不可少的辅助因子。 ZFN：锌指核酸酶是由FokI限制性核酸内切酶当中的非特异性的DNA切割结构域和锌指蛋白（zinc-nger protein）组合而成的。ZFN二聚体（dimers）能够促使DNA断裂形成DSB，进而诱发DSB修复机制。锌指结构域的靶向功能使ZFN能够对基因组中的特定位点进行定向改造。 ZFNickases：锌指切口酶（zinc-finger nickases）也是ZFN，不过是在其中两个FokI限制性核酸内切酶结构域当中的一个结构域发生了失活突变
14、的ZFN。锌指切口酶只能够形成DNA单链断裂（single-strand DNA break），所以只能激活同源重组修复机制，不能激活NHEJ修复机制。 定制的DNA结合结构域 ZFN和TALEN极强的“适应性”源自我们可以对这些核酸酶里的DNA结合结构域进行个性化的定制，使其能够特异性地识别各种DNA序列。这些DNA结 合结构域能够与背景知识框1里介绍过的各种效应元件（effector domain），比如转录活化因子、转录抑制因子、重组酶（recombinase）、转座酶（transposases）、DNA和组蛋白甲基转移酶 （methyltransferases）以及组蛋白乙酰基转移酶（
15、acetyltransferases）等搭配，来对基因组进行各种改造，比如对基因 组的结构或者基因组的功能进行改造等。由此可以看出，其中最关键的因素就是各种核酸酶对DNA结合的特异性和亲和力。下面，我们将重点介绍几个比较成功 的，组装这些DNA结合结构域的方法和技术。 Cys2His2锌指蛋白 Cys2His2锌指结构域是在真核生物中最常见的一种DNA结合基序，在人类基因组中也是编码频次排名第2的蛋白结构域。一个锌指大约由30个氨基酸 组成，形成了一种保守的结构（图1A）。在锌指螺旋结构表面的那几个氨基酸能够与DNA大沟上的3个碱基结合，不过这种结合的选择性会有所差异。 由于锌指蛋白具有这种分
16、子结构，所以非常适于打造个性化的DNA结合蛋白。在锌指蛋白特异性识别DNA序列的应用当中，最关键的工作就是设计出人造的、非 天然的组合，比如含有3种以上的锌指蛋白DNA识别结构域的蛋白。高度保守的链接序列（linker sequence）的出现使这种设计成为了可能，因为有了这种链接序列，我们就可以设计出能够识别918个碱基长度的DNA序列。在一段 680亿个碱基组成的DNA序列里，18个碱基组成的序列就足以成为一段特异性的序列，所以如果能够设计出含有3种以上的锌指蛋白DNA识别结构域的蛋 白，那么就意味着科学家们能够利用锌指蛋白识别出人类基因组里的任意一段DNA序列。虽然这种理论在最开始还存在一定的争议，但是后来发现，如果要识别复 杂基因组中某一段特定序列的DNA片段，这种设计策略的确是最佳的方案。 基于前期开展的论证研究（proof-ofprinciple）成果，科研人员们又开发出了好 几种新的构建锌指蛋白的策略和方法，这些 锌指蛋白在DNA结合的特异性方面都
