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1、EGF对体外培养人牙髓细胞影响机制探讨1.材料与方法1.1主要试剂及其配制：胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM培养基、胰蛋白酶（Hyclone公司，美国）；EGF（上海近岸蛋白质科技有限公司）；健康的成人牙齿；免疫组化试剂盒（上海圣工）；兔抗鼠EGFR多克隆抗体（SantaCruz公司）；SP和DAB试剂盒（北京中山公司）。1.2实验方法1.2.1免疫组化方法检测人健康牙齿中EGFR受体的表达1.2.1.1标本的制备1.2.2.1健康牙髓组织来源及处理：从青岛市口腔医院收集到的因正畸需要或阻生需要拔除的完整、无龋坏的牙齿，参照Gronthos等的方法，将牙齿进行消毒处理后，在40 g/L多聚
2、甲醛液4固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，制备5μm厚的连续切片。1.2.1.2免疫组化染色：采用SP法，石蜡切片脱蜡至水，30mL/L过氧化氢液室温下孵育10 min以消除内源性过氧化物酶，微波处理20min，室温下冷却30min，正常山羊血清室温孵育15min，滴加一抗（1100），4湿盒过夜，37复温1h，滴加生物素化二抗，37孵育15min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37孵育15min，DAB显微镜下控制显色。上述各步之后均用0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。阴性对照用PBS代替一抗，苏木精轻度复染（用于图像分析的不复染），常规脱水，二甲苯透明
3、，封片。应用常规的光学显微镜观察免疫组化染色切片，在显微镜下根据人牙髓细胞形态区域的不同，将观察区域分为成牙本质细胞层，富细胞层以及中央的髓核部位的细胞染色结果。根据人牙髓细胞形态，选取牙髓组织中三个不同区域段的切片，显微镜下观察结果并拍照，免疫组化染色结果以细胞和组织中有棕黄色产物为阳性。每张切片随机观察10个视野。1.2.2应用组织块消化方法进行人牙髓细胞原代培养：采用组织块消化法培养原代细胞：人牙髓组织在DMEM完全培养液浸润下充分剪碎，呈约1.0mm3大小。在无菌离心管中置入人牙髓组织碎块，加入用量为牙髓组织量的10倍的消化液，置于37水温的恒温水箱中进行温和消化，37水浴温和消化15
4、min，当牙髓组织块呈疏松状时立即加入DMEM培养液终止消化。将离心管后弃去上清， 用移液管吹打使牙髓组织液呈单细胞悬液与松散组织块的混合态。后将细胞静置于37、5%的CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱内静置培养。在显微镜下观察至培养瓶底面积被牙髓细胞覆盖约80%时，即可按12的比例进行传代培养。1.2.3表皮生长因子对人牙髓细胞增殖的影响1.2.3.1细胞接种：取生长良好的第5代牙髓细胞，接种于A、B两块96孔平底细胞培养板中，使A、B两板细胞的终浓度分别为A板1x103/孔和B板2.5x103/孔，每孔加入细胞悬液量为200μl。A、B两板同时在37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱
5、中培养24h以备用于实验。1.2.3.2不同浓度表皮生长因子的制备：称取1mg 表皮生长因子粉剂，用含10%灭活FBS的DMEM培养液倍比稀释，使EGF终浓度依次为0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml共五个浓度组。1.2.3.3表皮生长因子对人牙髓细胞增殖的作用：在显微镜观察下，当A板中牙髓细胞铺满约三分之一板底、B板中牙髓细胞铺满超过半数板底状态时，按照试验设计，在各实验组依次加入含有不同浓度EGF的DMEM培养液，EGF的终浓度依次应达到0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml这五个浓度梯度，每个浓度组中包括6
6、个孔的细胞，每个孔的培养液量为200μl，空白对照组中各个孔的牙髓细胞相应的加入含10% FBS的DMEM培养液200μl。将A、B两块细胞培养板放在细胞培养箱内继续培养，显微镜下及时观察细胞生长及形态变化。培养72h后取出培养板，在每孔加入浓度为5mg/ml的噻唑蓝溶液20μl，继续在细胞培养箱内培养，随时在显微镜下观察细胞培养板中噻唑蓝的着色结晶情况。4h后，在每个孔加入200μl的二甲基亚砜（DMSO），充分振荡15min，收集细胞悬液。用酶标仪在490nm波长下测定各个孔的光密度值（OD值），计算其平均值，以EGF浓度为横坐标，OD值为纵坐标，制图。1.4数据处
7、理与统计学检验：将各个浓度组中的6个孔测定的数值以平均值±标准差（X±s）表示。数据系统采用SYSTAT软件包进行单因素方差分析，并比较各实验组与对照组之间的显著性差异。4讨论牙髓是牙体组织中唯一的软组织成份，在牙齿发育中和萌出后担负着形成牙本质及牙齿的防御修复、感觉、营养等功能。随着牙髓的增龄变化，牙髓成纤维细胞会减少，合成和分泌功能下降，自身的代谢与修复能力会逐渐的下降，但在受到一定刺激后，如暴露的前期牙本质或炎症细胞释放的生长因子，某些骨形成蛋白，细胞因子或炎症介质的剌激使其增生、分化成新的成纤维细胞和牙本质，以维持牙髓细胞新生和凋亡的动态平衡【1】。表皮生长
8、因子（EGF）是在1962年由 Stanley Cohen教授在小鼠颌下腺分离发现的，它一种能促进新生小鼠眼睑早开、牙齿早萌的蛋白活性物质，最早的临床发现是能够促进皮肤表皮的生长。EGF被广泛应用于创伤治疗、美容修复、消化道疾病以及肿瘤等各个方面的治疗。EGF广泛存在于体液和多种腺体中，通过多种作用方式作用于各种组织，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用，EGF是牙齿发育过程中一类与牙齿形态发育相关的生长因子【4】。有研究表明，EGF/EGFR在牙胚发育过程中的成牙本质细胞中有较强的表达。人体细胞中EGF表达受会抑制时会严重影响牙齿的发育。有学者发现表皮生长因子、表皮生长因子受体、成纤维细胞
9、生长因子等一些重要的刺激因素在牙齿发育期有重要的作用。通过免疫组化的结果可以得出，在健康的人的牙髓组织当中，在成牙本质细胞层上，EGFR受体的表达呈现阳性结果；在富细胞层上，EGFR受体的表达呈现阳性结果；在中央髓核部位，EGFR受体的表达呈现弱阳性结果，表明EGFR在牙髓细胞当中是存在表达的，尤其是在生长分化较为活跃区域的牙髓细胞中，EGFR的存在表达更为强烈。实验中用EGF作用于生长早期和生长旺盛期的人牙髓细胞，发现在0.1-1ng/ml的EGF可促进生长早期的人牙髓细胞生长增殖，在0.1-5ng/ml的EGF可促进生长旺盛期的人牙髓细胞生长增殖。通过结果可认为EGF可以促进牙髓细胞的增殖
10、生长，是牙髓能够进行增强自我修复能力的保证。本实验通过免疫组化的方法检测了EGF在人牙髓细胞中的存在，然后通过体外原代培养的方法获得了生长健康，活力旺盛的牙髓细胞，最后通过EGF作用于生长状态的牙髓细胞，来探讨EGF在人牙髓细胞生长分化过程当中的作用。具体有关EGF调控人牙髓细胞分化增殖及自我修复的机制，会在以后的实验当中进一步研究。参考文献【1】侍立志，王兆春.EGF、EGFR和IPCNA表达与大肠癌临床病理学特征及关系.中国普通外科杂志，2004，13（4）；253-256.【2】 Nieholson RI，Gee JMW，Narper ME.EGFR ande eancer prognosis.Eur Cancer，2001，37（Suppl 4）：S9-S15.【3】 Conlev J，Casler JD.Adenoid cystic cancinoma of the head andneck.Saint Louis：Mosby CV Company，1988：1-9.
