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1、植物ROS清楚系统基因研究摘要 环境胁迫植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶（APX ） 、过氧化氢酶（CAT ）和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。本文将主要介绍植物SOD、APX、CAT、GR的酶学性质和基因工程方面的研究进展。关键词： 活性氧，氧化损伤，酶促脱毒系统，基因工程非生物胁迫在植物体内产生一
2、系列的生理生化代谢反应，使植物的生长和发育受到影响，从而表现出不利的表型性状。其中最主要的危害之一就是在生物体内产生大量的活性氧，过量的活性氧对生物体能产生不同程度的危害，为了消除或降低这种危害，植物体内存在着抗氧化保护酶系统和非酶系统，使植物体内活性氧含量处于一个平衡状态而免于受到氧化胁迫伤害。因此，通过降低植物逆境状态下的活性氧水平，可以减少逆境对植物产生的危害。下图是活性氧的产生途径以及还原途径：植物抗氧化系统需氧生物在进化过程中为保护自身免受AOS的伤害形成了内源保护系统,由非酶抗氧化剂和抗氧化酶类组成。在正常新陈代谢过程中,抗氧化系统可保持活性氧之间的平衡从而维持细胞的正常生理功能,
3、但在胁迫条件下,活性氧在短时间内的大量激增常常超出了内源清除系统的解毒能力,造成对生物体的伤害。植物非酶抗氧化剂有谷胱甘肽、氢醌、甘露醇、维生素C和E、B-胡萝卜素、生物碱等有机小分子。目前在植物中已发现的抗氧化酶类包括超氧物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)等,它们主要存在于叶绿体和胞浆中,形成高效的抗坏血酸-谷胱甘肽循环。活性氧的酶促脱毒系统中相应的酶1.1 超氧化物歧化酶（SOD）SOD 作为植物抗氧化系统的第一道防线，清除细胞中多余的超氧根阴离子。在高等植物中，SOD 根据其辅基部位结合的不同金属离子分为 3 类：Mn-SOD、Fe-SOD、Cu/Z
4、n-SOD5。对 SOD 基因家族的深入研究是在玉米中进行的。已得到的序列分析表明，广泛存在于真核生物中的 Cu/Zn-SOD 与 Fe-SOD 和 Mn-SOD 不同源。2.2 抗坏血酸过氧化物酶(APX)APX 是清除 H2O2的主要酶类，根据其在植物细胞中的定位分为 4 类：类囊体 APX、微体 APX 和细胞质 APX。APX 催化 H2O2还原的化学反应如下：2 抗坏血酸+H 2O22 单脱氢抗坏血酸+H 2O32。产生的单脱氢抗坏血酸可通过不同的途径被还原。2.3 过氧化氢酶（GAT）过氧化氢酶主要存在于植物过氧化物酶体与乙醛酸循环体中，它与 APX 一样都是清除H2O2的主要酶类
5、。过氧化氢酶可催化如下反应：2H 2O2O 2+2H2O。它与 APX 的不同之处在于：前者不需要还原力且具有较高的酶活速率，但对 H2O2的亲和力较弱，后者需要还原性底物，并对 H2O2具有较高的亲和力。3. 活性氧的非酶促清除及相关分子3.1 抗坏血酸和谷胱甘肽抗坏血酸和谷胱甘肽在活性氧脱毒过程中起重要作用，它们可直接同 ROS 反应，将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中扮演重要角色。抗坏血酸、还原型谷胱甘肽及 APX、GR、SOD 和 MDHAR 都参与了植物细胞中抗氧化剂的再生过程。3.2 甘露醇甘露醇是已知的氢氧根离子清除剂。在氧化胁迫下，甘露醇可以保护巯基酶类或其他巯基调
6、控的叶绿体组分，如黄素蛋白、硫氧还原蛋白和谷胱甘肽。这可通过离体类囊体实验证明：在适当浓度的还原态金属离子存在下，离体类囊体可以产生 OH-，磷酸核酮糖激酶（PRK）作为卡尔文循环中巯基酶类的代表可与产生的 OH-发生作用，然后分别加入甘露醇、甲酸内、过氧化氢酶，通过检测 PRK 的活性来验证它们对 OH-的清除能力。3.3 类黄酮最近研究发现类黄酮与抗坏血酸和 -生育酚一样，是主要的活性氧清除剂。体外研究表明类黄酮可以直接清除活性氧，如超氧化物（O 2-）、氧化氢（H 2O2）、氢氧根离子（OH -）或单氧（O 2） 34。但在体内却未必如此，因为类黄酮主要定位于液泡，而活性氧离子并不能从叶
7、绿体扩散至液泡中，因而在植物细胞中，类黄酮只能在活性氧的产生部位或附近部位进行清除，如液泡或细胞壁。而 H2O2却比较稳定而且能够穿过生物膜，故而类黄酮在 H2O2的清除中扮演极为重要的角色。利用氧化代谢基因工程提高植物抗逆性的研究进展生理学研究表明,抗氧化酶类是植物抵抗氧化胁迫的关键因素。其主要依据有:逆境胁迫引起抗氧化酶活性增加,且增加的酶活性与耐性直接相关;用一种胁迫对植物预处理可产生对其它不同胁迫的交叉耐性。因此,为提高植物抗氧化能力而进行的基因转移多集中于在植物中高表达单个抗氧化酶类基因,其中最常用于转化的是编码 SOD、APX 和 GR 的基因。1植物超氧化物歧化酶基因工程研究目前
8、，已经从多种植物中克隆了sod基因，并将其转入其他植物中，实验结果显示，转基因植株中sod基因的过量表达不同程度地提高了植株对环境胁迫的抵抗能力。在抗冻害方面，Bryan(1999)将烟草Mnsod转入苜蓿中，造成了转基因植株的Mn-SOD活性显著增强。在田间耐寒试验中，转基因苜蓿的存活率显著高于未转基因对照，而且在来年的采收中转基因植株的收获量是对照的两倍1，产量明显提高。除了能够增强抗旱性外，sod转基因植株对强光也表现出较强的耐受性。Ashima(1993)等人从豌豆叶绿体中克隆了Cu/Zn-sod，并将其转入炯草中，结果表明阳性转基因植株中SOD酶活性提高了3倍左右，同时APX酶活性也
9、随之升高34倍。进一步研究表明，转基因烟草在低温和强光处理作用下光合效率达到正常生长条件下的90，比对照组高出20左右。对除草剂的扰性研究表明，阳性转基因植株也具有较的耐受能力。2植物抗坏血酸过氧化物酶基因工程研究提高植物强光耐受性方面，转APX基因植株获得了较好的结果。Komyeyev等(2003)获得了转叶绿体APX基的棉花植株，APX在植物体内过量表达，其叶片中APX活性比野生型的提高5倍，但是抗光氧化能力并未得到明显提升。后来Komyeyev将SOD、tAPX、谷胱甘肽还原酶(GR)基因分别导入棉花中，使其过量表达，获得的转基因棉花具有较高的PSII光化学活性和抗氧化能力2，这说明要得
10、到植物体较强的抗氧化能力必须提高多个酶的活性，使其对氧自由基能够协同降解。Charles等(1998)研究大豆cAPXs中观察到，APX的转录、翻译和后转录调控可能会增强农作物抵抗环境胁迫的能力3。3过氧化氢酶基因的研究进展盐胁迫对植物叶片中CAT活性的影响已在葡萄、小麦、沙枣等植物中有报道，周建刚等(2007)研究苎麻在不同浓度的NaCl胁迫下抗氧化酶活性时，发现当NaCl浓度达到6 gL时，CAT酶的活性达到最大值4。王晓娟等(1999)利用花粉管通道将高梁DNA导入普通小麦陇春13号，在其后代中筛选出了抗逆性强的新品系，将转基因的小麦与陇春13号作盐胁迫处理，结果转基因品系的SOD、CA
11、T酶活均比对照高5。由于盐渍抑制正常的光合磷酸化和植物呼吸，引起和促进活性氧的产生，因而活性氧的清除与植物耐盐性紧密相关。近年来,利用氧化代谢基因工程提高植物对环境胁迫耐性的研究详列于表16。小结植物之所以被各种环境胁迫所伤害,常常是由于这些防卫系统不能及时启动,因此,通过加强信号传导使植物整个防卫系统快速启动将具有整体效果,其优越性比改变防卫系统内的单个成份应更为显著。然而,这一途径有两个问题必需解决,第一,由于AOS对生物有毒性的一面,因此,其提高的量对受体植物而言应有一定的上限,组成型的超表达可能并不是最理想的,分离诱导表达并快速启动的特异启动子同样十分重要。第二,H2O2究竟如何完成信
12、号传导过程及促进防卫基因的表达也有待进一步阐明。在植物细胞的研究报道中，抗氧化酶类的活性与植物的抗逆及抗氧胁迫是相关的，它们与抗氧化剂类物质一同参与植物体内活性氧的降解代谢作用。转抗氧化酶基因的研究证实转基因植株具有较强的抗逆性，这为植物抗逆性研究开辟了一条可行的途径。目前在这方面的研究还是处于起步阶段，绝大部分抗氧化基因工程的研究集中在单个基冈的研究上，一般是将基因构建在强启动子下表达，试图通过提高其中一个基因的表达水平来提高对氧胁迫的耐受能力，而忽略了对这类抗氧化基阕的调控响应元件的深入分析以及各个抗氧化反应之间的相互抑制以及代谢产物的堆积.参考文献：1 Bryan D McKersie，
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