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1、桃红四物汤对兔皮片移植模型Notch4受体影响的研究引 言皮片移植始终是创伤领域研究的重点与热点1，移植皮片成活的关键在于皮片与受区能否建立良好的血供关系，血供良好的受区可以为移植皮片提供丰富的营养，保证移植皮片的成活。移植皮片良好的血液循环的建立过程涉及到移植皮片的血管新生，新生的血管长入移植的皮片，重建良好的血运是皮片移植成功的重要因素。在我们的临床过程中，往往通过运用桃红四物汤治疗多种血瘀证，其中皮瓣移植术后证属气滞血瘀，以桃红四物汤促进皮瓣成活2。通过我们前期研究3：以桃红四物汤干预大鼠随意皮瓣模型，能增加新生微血管数量，并提高大鼠VEGF(血管内皮生长因子)的表达率。Notch 信号
2、通路包括 Notch 受体(Notch1 受体、Notch2 受体、Notch3 受体、Notch4 受体)、Notch 配体(Jagged1 配体、Jagged2 配体、Delta1 配体、Delta3 配体和 Delta4 配体)和 CSL(一种 DNA 结合蛋白)3 部分4。同时研究已证明，Notch信号通路在血管重建过程中发挥重要调节作用5。Notch 信号在血管新生方面已成为近来研究热点，特别是肿瘤细胞血管新生方面，国内外专家致力于阻段Notch信号通路，从而阻止肿瘤细胞血管新生，阻断肿瘤细胞血运来源，从而饿死;肿瘤细胞。然而，促进 Notch 信号通路方面研究相对甚少，移植皮片需与
3、受区重建血液循环，设及到血管新生，因此我们试想运用中医药促进 Notch 信号通路的表达，从而促进血管新生，为临床、科研治疗缺血性疾病提供新的思路。Notch 受体和配体在血管新生过程中的内皮细胞或周细胞中均有表达，但在血管组织中，最重要的是受体 Notch4 和 Delta 样配体6。近期研究证实 Notch4通过多方面调节血管新生7。因此，本课题以兔自体皮片移植为模型，通过阻断Notch 信号通路，检测其中 Notch4 受体表达情况，探究其与血管新生的关系。进一步再用桃红四物汤干预探究桃红四物汤促血管新生的作用机制。.第一部分 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物健康新西兰兔大白兔，1
4、0-12 月龄，雌雄各半，体重约(2.3±0.2)kg/只，均购自湖南中医药大学动物实验中心【SYXK(湘)2015-0004】，在湖南中医药大学 SPF级实验室中进行实验操作【SYXK(湘)2013-0005】，SPF 级兔料自由饮水进食，光照保持昼夜节律各 12h，室内温度控制在 24-26，相对湿度控制在 40%-70%。实验过程中参照国家关于善待动物的指导性意见对大白兔进行处置，并按照4R 原则给予人道关怀。1.1.2 药物 γ-分泌酶阻断剂(2S)-N-N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)8(美国 apexbio 提供,
5、型号 DAPT(GSI-IX),批号 1690401)二甲基亚砜(DMSO)溶剂9(由 BIOSHARP 公司提供,批号为:1132024）戊巴比妥钠(由 Merck 提供,规格: 5g/支)头孢拉定胶囊(石药集团欧意药业有限公司 规格:0.25 g * 36 粒)生理盐水(湖南科伦制药有限公司,规格:500ml/瓶,批号:k140501)桃红四物汤：依据·吴谦10医宗金鉴桃红四物汤的配比：当归 20 克、生地 20 克、红花 10 克、赤芍 20 克、川芎 10 克、桃仁 20 克。由本院药剂科制成含生药 4g/ml 的汤剂11。实验药物剂量按人与动物体表面积换算公式12D 兔
6、=D 人×R 兔/R 人(D 为给药剂量，R 为动物与人体表面积比值系数)计算桃红四物汤的给药剂量。.1.2 方法1.2.1 造模方法健康兔 6h 前做麻醉准备，术前备皮，标记手术区域。麻醉用 3%戊巴比妥钠，按 20-25mg/kg 标准行兔耳缘静脉麻醉。皮片移植术操作：固定兔后以 3%戊巴比妥钠左(右)耳缘静脉麻醉13。麻醉成功后，铺单、消毒，手术剥离兔背棘突第 3 胸椎棘突右侧 1cm，向兔尾长 6cm，厚度 0.5mm，宽 3cm，近长方形皮片，从对侧腹部剥离相同大小皮片移植于背部，并加压包扎，将腹部切口间断缝合14。假手术组只在背部相应区域用手术刀做同等大小的切口，切开皮
7、肤，深达皮下组织，但不进行皮下组织分离，间断缝合手术切口。术后头孢拉定胶囊，0.02g/kg/只，用蒸馏水配置成 1ml 药液，每 8h灌胃一次，连续给药 3d，以防止术区伤口感染。.第三部分 讨 论.173.1 皮片移植与血管新生 .173.2 NOTCH4 受体与血管新生 .183.2.1 Notch4 受体正常表达是血管正常发育的必备条件 .183.2.2 Notch4 受体过表达可致血管发育缺陷 .183.2.3 Notch4 受体表达不足可与 Notch1 受体相互代偿.183.2.4 Notch4 受体信号通路可促血管新生 .193.3 中医治疗皮片移植术后的研究现状 .193.3
8、.1 祖国学对皮片移植术后血管新生的认识 .193.3.2 活血化瘀代表方-桃红四物汤.193.4 实验研究结论分析.193.5 本实验不足之处.21第四部分 结 论.22第三部分 讨 论3.1 皮片移植与血管新生皮片移植始终是创伤领域研究的重点与热点，皮片移植术就是将供区取皮移植到受区，使其重建血液循坏，其中移植皮片能否成活和移植皮片与受区能否建立良好的血供关系非常重要17，移植皮片丰富的营养需由血供良好的受区提供，以利于移植皮片的成活，只有移植皮片与受区建立良好的血供关系，改善局部组织的代谢，才能促进创面的愈合。因此，血管新生是移植皮片成活的关键，是目前应用皮片移植术治疗各种皮肤缺损值得深
9、入研究的课题18。临床中常用自体皮片移植术治疗多种皮肤缺损疾病，能有效覆盖创面，恢复皮肤感觉、保护屏障功能，但是常常由于患者年龄、吸烟、血管弹性功能差等因素，影响移植皮片血管新生，或使新生的血管闭塞不通，从而破坏移植皮片血液循环的建立，使移植的皮片不能得到充分的营养，最终导致移植皮片坏死，坏死后常常需要再次行皮瓣手术，但也同样再次面临坏死可能，病情反复给患者在希望中带来失望，造成巨大的经济、心理负担。如何有效促进移植皮片成活成为广大医疗、科研人员深入思考的课题19。在提高移植皮片成果率，减少病人痛苦及经济负担方面，国内外专家做了大量研究，取得丰硕成果，其中刘嘉锋18认为提高皮片成活率在于早期重
10、建移植皮片血运。皮片成活与否在于早期减轻移植皮片炎症反应，积极预防感染，避免血管痉挛，因此临床早期常注重抗炎、抗感染、抗痉挛治疗避免皮片移植早期缺血、缺氧坏死。Taichman DB20对皮片移植术后血液循环建立的过程进行阶段性研究发现移植皮片成活在两个时间段特别关键，其一是在在皮片移植后最初 48 小时内，此段时间是移植皮片产生内源性固定的血浆营养期。其二是移植 48h 后至术后 4-5d 内，移植皮片血管新生重建血液循环过程。相关研究发现21，以兔皮片移植为模型，具有手术操作简单，皮片移植成活率高，血管新生明显等特点，因此我们以兔皮片移植为模型探究血管新生的作用机制。术后通过 2、5、8d 这 3 个时限为观察点，运用当前在血管新生方面具有代表性的 Notch 信号通路，探究 Notch 信号通路中与血管新生关系最密的Notch4 受体，在阻断剂阻断 Notch 信号通路的表达情况，再结合中医临床广泛运用于缺血性疾病或血管闭塞性疾病治疗的桃红四物汤干预，通过同样方法检测Notch4 受体，及兔移植皮片血管新生情况，揭示桃红四物汤促血管新生作用机制。.结 论通过实验我们得出以下结论：1、DAPT 阻断 Notch 信号通路可抑制 Notch4 受体表达从而影响血管新生。2、桃红四物汤可通过调节 Notch 信号通路中 Notch4 受体的表达从而促进血管新生。.参考文献（略）
