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1、百里香酚对沙门氏菌型分泌系统的抑制作用及医学机制前 言沙门氏菌是引发人类和动物食物中毒的首要食源性病原菌之一，也是在全球公共卫生学上有重要意义的人兽共患病原菌，该病原菌在自然界有广泛的宿主谱，主要寄居在哺乳类、爬行类、鸟类及昆虫的胃肠道中，绝大多数对人和动物均适应。沙门氏菌感染动物后常导致严重的疾病，主要侵害低龄动物，导致伤寒、败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症，并可引起怀孕母畜流产和死胎等致死性感染，给畜禽养殖业带来严重的经济损失。其中鸡白痢是沙门氏菌引起的以排白色粪便为特征的急性败血性传染病1, 鸡白痢沙门氏菌不但会通过饮水、空气及饲料等进行群间水平传播，还能通过携带病菌的种鸡垂直传播给下一
2、代，是危害养鸡业发展的重要传染病之一。猪霍乱沙门氏菌及猪伤寒沙门氏菌是猪败血症、肠炎及副伤寒的主要病原菌，该病常在密集型饲养的断奶仔猪中暴发，导致仔猪厌食、下痢、呼吸困难并最终引起仔猪死亡，有时甚至与其他病毒，如猪瘟病毒和蓝耳病毒等混合感染，发病率和死亡率更高2，3。目前临床上沙门氏菌感染较难控制，治疗效果往往不理想，给畜禽养殖业造成了巨大的经济损失，并严重威胁公共健康和食品安全。沙门氏菌引起的食源性疾病在我国居细菌性食源性疾病的首位4。2006-2010年间我国报告病因明确的细菌性食源性疾病暴发事件中，70%-80%是由沙门氏菌所致。美国平均每年有多达 120 万沙门氏菌的感染者， 其中超过
3、 23000 人需要住院治疗， 450 人因感染沙门氏菌而死亡5。欧洲食品安全局( EFSA) 2007 年 4月 3 日发布的沙门氏菌调查情况表明, 沙门氏菌在欧洲是引起人类食源疾病的第二大原因，2005 年共有 176395 人受沙门氏菌感染。根据 EFSA 的调查, 大约四分之一( 23.7%) 的肉鸡场存在沙门氏菌，三分之一种猪场发现沙门氏菌。目前针对沙门氏菌感染，普遍采用抗生素进行治疗，但由于抗生素的长期使用和滥用及其不可避免的易诱导耐药性等因素导致了沙门氏菌耐药性日益严重，耐药谱逐渐加宽6。这一现象对于临床上沙门氏菌感染的治疗更是雪上加霜。因此临床上迫切需要寻求新的抗感染策略及药物
4、来预防和治疗沙门氏菌感染。近年来研究发现病原菌的致病力与其分泌的各种毒力蛋白或效应蛋白密切相关，但上述蛋白分子不是细菌生命所必需成分。因此，以细菌特异性用于感染宿主细胞的蛋白或者蛋白复合物为靶标的药物，不仅可发挥抗感染作用，且其对细菌产生的选择压力小，不易诱导耐药性。型分泌系统（T3SS）广泛的分布于革兰氏阴性细菌中，其主要功能是分泌和转运病原菌毒力因子。对于沙门氏菌，其致病力便是通过两套 T3SS 系统分泌效应蛋白，分别介导细菌侵入和在胞内的增殖，在其致病过程中起着决定性作用7。此外，这些效应蛋白在细菌逃避免疫系统攻击过程中也有不可或缺的作用6。研究表明，敲除沙门氏菌毒力岛或编码效应蛋白的基
5、因显著降低沙门氏菌侵袭宿主细胞的能力。中药自应用至今已有数千年的历史，其中的有效化学成分在抗细菌感染方面的作用已确证。这些天然化合物具备分布广泛, 结构多样, 生物学活性丰富等多方面的优势，是新药开发和先导化合物发现的宝贵资源。而且由于这些有效化合物往往不具有传统的杀菌活性，其诱导耐抗药性的可能性也很低。本项目以沙门氏菌型分泌系统为药物靶标，从抗毒力角度出发筛选及研究天然化合物在抗沙门氏菌细菌感染过程中的作用及其机制，为畜禽养殖降低或替代抗生素的应用和临床上有效防治沙门氏菌及其它革兰氏阴性菌感染提供新的研发策略和先导化合物。另外，这些化合物也可做为分子探针，用于探讨型分泌系统工作机制，为进一步
6、开发精确高效抑制其功能的化合物提供理论基础，因此具有重要的科学及实践意义。.第一篇 文献综述第 1 章 沙门氏菌研究进展沙门氏菌是引起人类及动物食物中毒的首要食源性病原菌，也是全球公共卫生学上有重要意义的人兽共患病原菌，该病原菌在自然界有广泛的宿主谱，主要寄居于胃肠道，引起胃肠道感染。同时沙门氏菌也是导致畜禽养殖业遭受经济损失的重要病原菌，严重威胁着人类公共健康和食品安全，因在人类及动物中高的发病率，引发世界各国对抗沙门氏菌感染的研究高度重视。1.1 微生物学特性沙门氏菌属是在 1885 年被美国病理学家沙门所发现。发现至今的 130 年时间里，超过 2500 种血清型被描述为沙门氏菌8; 但
7、是，因为它们很罕见，科学家对它们知之甚少。在大多数人类感染中，少于 100 种血清型。沙门氏菌属，为革兰氏阴性细菌，无芽孢的棒状杆菌。菌体直径大小为 0.6-0.9μm，菌体长度为1-3μm，菌体两端钝圆，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外其他类别沙门氏菌均周身有鞭毛，属兼性厌氧型细菌。沙门氏菌在 10-42均能够生长，35-37为其最适生长温度，最适 pH值为 7.0±0.8。对周围环境的营养要求不高，普通培养基便可以生长旺盛，高盐环境利于其生长。沙门氏菌在普通琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美兰培养基上，呈现出光滑、圆形、无色半透明 S 型菌落，R 型菌落边
8、缘不整齐表面干燥。生化反应特性：不发酵乳糖和蔗糖，不产生吲哚，不分解尿素，对苯丙氨酸不脱氨，VP 实验阴性，大多产生硫化氢。发酵甘露醇、山梨醇、葡萄糖和麦芽糖，除伤寒杆菌产酸不产气外，其他沙门氏菌均产酸产气。.1.2 流行病特征沙门氏菌为一种重要的人兽共患病原菌，该病原菌在自然界有广泛的宿主谱，存在于土壤、粪便、和被污染的水及食品中。人饮用被污染的水和误食被污染的食物是引起沙门氏菌感染的主要途径。畜禽养殖者，直接接触沙门氏菌感染的动物及被污染的肉类或者饲料，同样会引起沙门氏菌感染。人类感染沙门氏菌后的 72h 内，主要表现为腹泻、高烧、腹部疼痛。患者患病时间通常为 4 到 7 天，大部分个体在
9、治疗后得以恢复9。部分个体会从腹泻开始发展更为严重从而需要住院治疗。在这部分患者中，沙门氏菌的感染可能会从普通的肠道感染通过血液传播逐渐发展成为系统性感染。如果不能够及时给予抗生素进行治疗，可能会导致人的死亡。大于 65 岁的老人、小于 5 岁的婴幼儿等免疫力低下的人群或者糖尿病、癌症及艾滋病等免疫缺陷的患者更容易引起严重的疾病。某些血清型的沙门氏菌由于已经形成了耐药性，感染后便增加了住院治疗的风险，更容易引起机体的系统性感染，甚至可能会因为多重耐药而导致治疗失败。调查显示，从个体感染沙门氏菌后，到区域性的沙门氏菌疾病爆发流行大约需要两周到四周的时间（图 1）。.第 2 章 百里香酚体内外药物
10、活性评价.472.1 材料与方法 .472.2 实验结果 .532.3 讨论.572.4 小结.58第 3 章 百里香酚抗沙门氏菌型分泌系统的作用机制.593.1 材料和方法 .613.2 结果.703.3 讨论.833.4 小结.83第 3 章 百里香酚抗沙门氏菌型分泌系统的作用机制自上个世纪 90 年代以来，科学技术的不断推进以及生物科学领域检测手段的不断发展，为我们发现药物作用靶点，化合物的作用机制分析提供了硬件条件。质谱技术的发展为我们能够快速准备的发现药物作用靶点提供了技术支撑。随着对分子生物学和生物化学深入研究，点击化学技术和圆二色谱技术的发展，更为我们研究化合物与靶蛋白相互作用提
11、供了理论依据。前面三章研究提示百里香酚能够抑制沙门氏菌型分泌系统的功能。为了能够阐明百里香酚抑制型分泌系统的作用机制，本研究应用生物化学、分子生物学、质谱技术、点击化学及圆二色谱技术手段，研究百里香酚的作用机制及作用靶点。3.1 材料和方法3.1.1 材料3.1.1.1 菌株和质粒鼠伤寒沙门氏菌野生株 SL1344 由美国普渡大学罗招庆教授惠赠, JS749att:pDX1:hilA-lacZ、JS751 att:pDX1:sopB-lacZ、JS752 att:pDX1:sicA-lacZ 和JS753 att:pDX1:hilA-lacZ 菌株由美国伊利诺伊大学 James M.Slauc
12、h 教授惠赠。Δlon 及 ΔinvA 缺失菌株由美国普渡大学周道国教授惠赠。pGEX-6P-1、pKS、pRK600、pZLQ、pKD3、pKD46 和 pET32a 空质粒均购自 Invitrogen 公司。.3.1.1.2 药品及试剂Β-lactamase 鼠单克隆抗体及 Flag 鼠单克隆抗体，购自 Abcam 公司; sipA 鼠多抗由本实验室制备; ONPG购买自sigma公司; 考马斯亮蓝（R250）购买自sigma公司; GST 标签和 His 标签亲和层析柱，购自 GE healthcare 公司; 过硫酸铵、30%的丙烯酰胺、Tris Ba
13、se、TEMED、10%SDS 及甘氨酸均购自 Sigma 公司；蛋白胨及酵母粉等细菌培养用试剂购自 OXOID 公司；DNAMarker、质粒小提试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒及 DNA 清洁回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；ONPG、Amp（氨苄青霉素）、Kana（卡那霉素）、Cm（氯霉素）、IPTG、蔗糖、 L-阿拉伯糖等试剂均购自 Sigma 公司； BamH、Sal和 Dpn等各种限制性内切酶、T4 DNA 快速连接酶、Pfu 高保真酶和预染蛋白 Marker 均购自 NEB 有限公司；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购自 Sigma公司；其他各种常规化学试剂购自北京化工厂。.结 论1. 成功建立沙门氏菌型分泌系统筛选模型，并筛选到百里香酚等多种型分泌系统抑制剂；2. 百里香酚对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠具有有效的治疗作用；3. 百里香酚与效应蛋白 SipA 发生相互作用，引起 sipA 构象发生变化进而被蛋白酶 Lon 降解。.参考文献（略）
