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1、遗传HEREDITAS (Beijing) 8 (3): 28-30 1986鱼类染色体转移仙台病毒融合胚胎细胞核移植的初步研究郑瑞珍杜森高晓虹陆德裕（中国科学院发育生物学研究所，北京）细胞杂交技术近二十年来取得了巨大的成就，现已被广泛地应用于医学和生物学各个领域4,51。但是体细胞杂交只能得到杂交的细胞，还不能得到杂交的个体，至少在动物界是如此。在植物方面已经能通过原生质体的融合产生杂交细胞，再通过杂交细胞的培养产生新的再生植株2,71。而动物的繁殖只能由生殖细胞通过胚胎发育才能产生新的个体。虽然不少人曾做了许多尝试，想通过卵子和体细胞人工融合的方法产生杂种，但迄今还没有成功8-10,131
2、0童第周等11,11,121在鱼类细胞核移植方面做了不少工作，利用鱼类囊胚细胞的核，移植到不同属和不同亚科的去核未受精成熟卵内，得到了几种核质杂种鱼。这些工作不但证明了鱼类早期囊胚细胞具有发育的全能性，同时也说明利用动物早期胚胎的体细胞核育种的可能性。那么用囊胚细胞的融合引进外来的染色体以及改造原有细胞的遗传组分，然后把融合的囊胚细胞的核移植到去核的未受精的成熟卵里去，是不是能产生具有新的遗传性状的个体呢？本实验正是基于这样的目的进行的。首先我们使用同源的囊胚细胞融合，然后移植核，以了解：(1)鱼类囊胚细胞融合的条件；(2)融合后的囊胚细胞核移植是否能促使卵子发育；(3）发育的胚胎染色体组成如
3、何？以便为导人异源染色体创造条件。按童第周等川的鱼类细胞核移植的方法，卵子经人工授精，待其发育至高囊呸随即放人4冰箱使发育速度延缓，以备融合之用。融合之前用尖镊子剥去卵膜，将去膜的卵子放人盛有Holtfreter液的培皿里，然后用发圈把胚盘从卵黄上切割下来，再用嘴控移液管把胚盘转移到分离液（含EDTA的缺钙、缺镁的Holtfreter液），在室温下放置2一3分钟，再用微吸管吹打，使其分散成单个的囊胚细胞，用Holtfreter液洗两次，然后挑选大小较一致的圆形囊胚细胞，双双放在盛有9-丙内醋灭活的仙台病毒液(6，的多孔血凝板上或孔的培养板里。每孔两个细胞，使彼此粘连在一起，在37下孵育15-2
4、0分钟，再在解剖镜下检查融合情况。把融合的囊胚细胞挑出放在Holtfreter液里。然后转移到含15务小牛血清的MEM培液里。在28培养2-16小时，做为核移植用的供体细胞。细胞核移植与过去已报道的方法相同，卵子经人工挤出后用玻璃针在极体处将卵核挑出，然7Ft将融合细胞的核植人，待其发育，手术在Holtfreter液中进行，室温为18-250C,（二）单个金鱼早期胚胎染色体的制备在制备染色体前，先将发育至囊胚、原肠i1f,材料和方法（一）金鱼囊胚细胞的分离、融合和细胞核的移植Zheng Ruizhen；al.: Transfer of Fish Chromo-somes-Preliminary
5、 Study of Nuclear Transpla-ntation of Fused Embryonic Cell by Sendai VJCUS本文于1985年3月20日收到。28和视囊期的核移植胚，分别转移至含秋水仙素1001zg/ml Holtfreter液里。在室温中孵育1小时，然后一切割胚盘，分离细胞。将分散的囊胚细胞转移到一干净的架在密闭的培皿内的载玻片上，载片上加低渗液处理1小时，然后用酒精冰醋酸蒸汽固定31，进行Giemsa染色。染色体的计数采用两种方法：(1)把染色体分散较好的中期细胞（M）拍照放大，然后计数。(2）在油镜下，用带方格的目微尺对已拍照计数的M细胞里的染色体逐
6、格逐个计数，最后把两种计数的结果互相验证，得出较正确的数字，确定为该M细胞的染色体数。结果囊胚细胞的融合，是用较好的新鲜分离的细胞，和融合效率较高的病毒，融合率接近30务。囊胚妙吐的融合与体细胞一样在370C15-20分钟公J能完成融合。图版1, 1-3显示整个融合过程。早期的囊胚细胞是同步的，后期囊胚细胞并不完全同步，因此同一批所得的融合细胞，有些是双核合胞体（图版1,3)，有些则是两团染色体。把这种融合细胞的核移植到去核卵内（18-250C)，大约在1小时左右即进行第一次卵裂，并开始发育。一共移植了249个去核卵，其中得到囊胚103个，原肠胚19个，视囊期3个，另外一个存活了48小时，但不
7、再分化而呈一球状胚胎。发育的胚胎占移核卵的50多强，其余50务的卵不发育，少数分裂为2细胞或4细胞，以后很快就解体了。核移植胚胎在室温下其早期发育时序与正常对照胚胎的发育时序是一致的，一般都在4小时左右到达囊胚期（图版1, 4)，往后发生各种阻滞。图版1,5为发育至视囊期移核胚胎，在照片上，隐约可见9对体节，整个胚胎的形态是正常的，但发育速度较正常胚胎迟缓，因此用它们制备成染色体标本观察。图版1, 6的移核胚，视囊已进一步分化成视杯，但胚孔还没有完全闭合，显然发育已经受到阻滞而变成怪胎。由于囊胚细胞分裂周期短，染色体处于较不凝缩状态，因此染色体细长，尤其是超二倍体的M细胞很难制备出好的图像。再
8、之大多数胚胎都是在出现阻滞后才用来制备染色体，因此分裂相较少。我们一共制备了11个移核胚胎的染色体标本。另外还制备了3个正常囊胚晚期胚胎的染色体标本做为对照。正常囊胚共统计了23个M细胞，每个M细胞都含100条染色体（图版11,夕）。如果按细胞所含染色体数量来分类的话，那么正常囊胚只有一种核型。而11个表1转移胚胎的染色体分析实验组别时期c数一一妙、一、M思_e一冬100一2301991811;01151150！1311oI10199一81so一7170一50细胞种类对照122囊胚囊胚囊胚Z11）115111融合细饱核移植组：FN1）123斗56了891011An如11d2639391462
9、1！911211111113211斗111111131311311242432225牛2原肠原肠囊汪囊胚囊胚囊胚囊胚囊胚囊胚囊胚29移核胚胎核型变化较大，各含不同数量的染色体，有些为65个染色体，有些为77, 110, 168,190, 200（图版11, 8-10)，还有一个具有230个染色体。为了便于制表，现将染色体分为9个等级（表1)，然后把每个胚胎已计数的M细胞的染色体编到该范围去。从表1可见每个移核胚胎都由两种以上含不同染色体数的细胞组成，也就是说所有的移核胚胎核型是嵌合的。有些胚胎由两种核型组成，有些由3种,4种或，种核型组成，但最多不超过5种。每个胚胎参加嵌合的几种细胞的数量并不
10、均等，一般都有一主要核型。现以融合细胞核移植1号（FNTI )和9号（FNT9)胚为例（图1), 1号胚共有1I个可计数的M细胞，含110个染色体的M细胞为7个，约占M细胞总数的64并，其余约占36并。9号胚共14个可计数的M细胞，含100个染色体的M细胞为9个，约占M总数的64多，200个染色体的M细胞为2个，约占14沁，其余各占7务(168, 10, 77个染色体）0次哥杀海契舞1M1M染色体数入图1 FNT9和FNT1胚胎几种细胞的组成口圈FNT9胚胎FNT1胚胎M：分裂中期细胞。上而的结果说明，融合的囊胚细胞核移植到去核卵后，既能促使受体卵发育，又使移核胚胎染色体普遍发生重排。因此利用
11、这一技术有可能获得各种含不同数量染色体的鱼类细胞群。如果把这些细胞群培养起来，对于开展鱼类细胞遗传学和基因定位工作是十分有用的。其次根据11个移核胚胎染色体的分析，其中有9个胚胎有超二倍体的核型，说明有82多的胚胎染色体转移成功。在249个移核卵中有3个发育至视囊期，有了肌节、视囊和脑的分化。以含有110条染色体为主要核型的胚胎，具有较正常的形态发生和发育到较晚期。这说明利用这一技术系统，有可能把外源染色体导入卵子使参与个体的发育，因此可以用来研究鱼类外源染色体对发育的影响和探索改良品种的可能性。参考文献1中国科学院动物所细胞遗传研究组等；1980。中国科学（英文版）(Scientia Sin
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