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1、生物制药行业中连续生物加工的应用综述关键词：连续生物加工; 生物制药; 发展; 应用; 机遇与挑战;Abstract：Recently, continuous bioprocessing gains increasing attention due to its wide application in biopharmaceutical and other fields.It is important to analyze the developments and progresses of continuous bioprocessing and its applications in th
2、e production of biopharmaceuticals, such as monoclonal antibodies, for the development of biotechnology industries.It is also important to better understand the advantages of continuous bioprocessing compared with the traditional batch processing and to overcome the existing problems and challenges
3、in the biopharmaceutical industry.With the pursuit of flexibility and standardization, continuous bioprocessing will play a critical role in biopharmaceutical and biological industries.Keyword：continuous bioprocessing; biopharmaceutical; development; application; prospect and challenges;目前生物产品的商业化生产
4、大多为分批加工过程, 分批加工可实现产品关键质量的离线检测。但分批加工存在着设备占地面积大、前期投入成本高、操作繁琐和成品质量不稳定等不足。随着生物制药行业的发展, 对生物合成技术的要求也越来越高。以往传统的批次生物加工方法已经不能满足当今社会对于高产量、低污染的要求, 批次加工向连续生物加工转变已成为工业生产的发展趋势1。连续生物加工概念于30多年前提出, 是指利用连续的物料流动通过各种单元操作达到一个稳定状态, 同时生产质量均一产品的过程2。由于潜在优势众多, 连续生物加工在生物制药行业的应用日益广泛3。1 连续生物加工的研究进展及应用现状1.1 连续生物加工的研究进展过去的10多年里,
5、治疗用蛋白药物尤其是抗体相关产品的市场已经发生了显着的变化, 生物医药市场增长率每年超过10%4,5,6。对药效要求的提高以及个性化用药趋势的发展都导致药物的产量降低7。重磅新药品种研发难度的增加以及生物仿制药发展带来的竞争增大了生产商的成本压力6,7,8,9,10。此外, 制药公司为向新兴市场提供患者可负担得起的药物进一步增强了对高效生产过程的需求11。据市场调研公司Evaluate Pharma预测, 2018年全球处方药销售额将达到8 850亿美元, 全球药品研发支出预计达到1 490亿美元。未来生物制药行业充满机遇, 因此对生产过程也就有了更高的要求12。为保持或加强市场地位, 生物制
6、药工业将依靠低成本和灵活的生产设施以适应市场发展。与批次加工系统相比, 利用连续生物加工的系统具有降低制造成本、简化制造设备规模、改善产品质量以及再生和标准化终产品等明显的优势13。其中最大的优势是增加了设备灵活性和降低了成本。生产规模上的灵活性是指可生产包含大批量和小批量药物在内的广泛产品组合14。Walther等15指出:相对于传统的批次加工, 连续生物制造过程可以降低55%的成本, 例如利用连续生物加工技术生产非单克隆抗体产品, 运营成本可从批次处理的每克1 230美元降到每克250美元。Hammerschmidt等16指出:使用标准的批次过程生产单克隆抗体, 色谱纯化一、二期的总成本为
7、5 500万美元, 而使用基于连续沉淀纯化的连续过程时, 色谱纯化一、二期的总成本花费仅为1 600万美元, 成本降低了70%以上。连续生产的大部分成本优势来自于更少的生产设备和占地面积的投入。较小的生产规模有利于提高容量利用率、减少产品转换、简化生产放大过程17。表1总结了批次生物加工与连续生物加工的优缺点。表1 批次生物加工与连续生物加工的比较Table 1 Comparison of batch bioprocessing and continuous bioprocessing连续生物加工目前还处于探索阶段, 从批次加工到准连续加工再到连续加工是一个渐进、探索的过程。在未来, 为了降低
8、成本和提高生产力, 小规模的综合连续加工步骤可以作为当前批次加工的一种替代方案。而对于一些中小企业而言, 将原传统批次加工生产完全转换为连续生物加工, 需要开发全新的上游加工流程和下游单元操作设备, 投入较大14。因此, 采用半连续生物加工是探索连续生物加工阶段的一个较好选择。Pollock21提出了一种综合实验方法和模型, 用于评估半连续色谱法获取单克隆抗体在临床和商业生产领域的应用潜力, 过渡方法可以是连续的上游处理结合传统的批次下游处理, 也可以是完整的连续下游处理与批次的上游处理整合。早在1995年, Yamane等22就将半连续的部分流程整合到批次加工系统中, 用于种子的培养和生产。
9、采用连续上游加工是为了消除潜在的可以限制细胞生长和生存能力的有毒代谢产物, 维护恒定的营养水平, 不仅可以减小对敏感细胞压力, 且除去发酵液中不稳定的蛋白质可以消除种子退化的风险。1.2 连续生物加工的应用现状上游连续加工已在单克隆抗体等生物制品的生产中推广应用。Rodriguez等23利用上游连续加工生产干扰素, 采用的连续灌注法在改善了产品质量的同时也缩短了培养时间, 降低了抑制浓度, 由此提高了生产力。Luttmann等14将一个完整的连续下游加工整合到原有的批次循环上游过程, 组成半连续生物加工过程, 以毕赤酵母作为宿主系统生产疟疾疫苗, 取得较好的成效。辉瑞公司利用连续和半连续培养工
10、艺生产抗血友病药物重组抗血友病因子ReFacto AF和重组人凝血因子IX, 结果表明连续加工过程不但增加了设备的操作灵活性, 还确保了细胞系的遗传稳定性24。利用连续生物加工生产单克隆抗体、非单克隆抗体、治疗蛋白、重组细胞、干细胞、凝血因子以及疟疾疫苗等药物方面的尝试, 对未来连续生物加工的技术成熟和全面商业运用提供了经验。Castilho25通过灌注细胞培养生产重组治疗蛋白的过程探索了连续生物加工的整合过程。Jungbauer26介绍了生物制药的下游加工过程中的相关装置, 为实现工业化应用提供指导和借鉴, 图13为生物制药连续下游加工的流程及其相关设备。图1显示细胞分解后经连续的重折叠,
11、纯化修正获得重组蛋白质的生产流程。图2, 3是重组蛋白连续的下游离心设备及过滤设备, 通过连续的离心和过滤处理, 能进一步提高重组蛋白生产的效率及灵活性。图2中箭头表示溶液的流向, 弯曲的箭头和虚线分别表示自旋方向和自旋轴。图1 重组蛋白质生产下游加工的总流程Fig.1 General process of downstream processing for re-combinant protein图2 用于重组蛋白生产下游加工的典型离心设备Fig.2 Typical centrifuge configurations used in down-stream processing of rec
12、ombinant protein图3 连续过滤单元操作及其相关设备Fig.3 Continuous filtering unit operation and related equipmentZydney27综述了适合连续下游生物加工的最新分离技术, 着重介绍了最适合单克隆抗体等分泌蛋白生产的单元操作, 对高价值生物制品的连续下游加工作了回顾。Rathore28综述了20052015年间连续生物加工的主要进展, 介绍了上游和下游连续生物加工的各种设备, 对其应用和优缺点进行了讨论, 结果见表2。表2 连续生物处理上下游处理设备及其优缺点Table 2 Advantages and disadv
13、antages of equipment in con-tinuous upstream and downstream processingWalther等15探索了用连续生物处理进行重组蛋白生产的经济性, 并对连续生产单克隆抗体 (mAb) 和非单克隆抗体 (non-mAb) 进行了定量和定性的比较, 结果见表3, 4。表3 生物工艺及相关设备说明Table 3 Description of biological processes and related equipment表4 对批次和连续平台的高水平过程假设Table 4 High-level process assumptions f
14、or both conventional and continuous platformsGodawat等29,29构建了一个完整的端对端 (endto-end, 端对端) 连续生物加工系统, 该系统是一个耦联两个周期性逆流色谱系统的连续灌注生物反应器, 并用于单克隆抗体生产。图4是连续上游加工结合传统批次下游加工的组合生产方式, 相对于整个过程的批次加工, 连续上游加工过程消除了潜在的有毒代谢产物, 一定程度上提高了设备的灵活性;图5是完全连续生物加工过程, 相对于图4的生产方式, 这种连续加工系统精干、灵活, 可控性强, 简化了操作步骤, 节省了成本, 更适于过程优化和控制。图4 连续上游
15、加工和捕获组合批次下游加工Fig.4 Continuous upstream+capture, batch downstream图5 端对端连续上游加工组合连续下游加工Fig.5 End-to-end continuous upstream and downstream连续灌注技术在工业生产重组凝血因子上的成功应用已有20多年历史24。Xenopoulos等30描述了一个连续的下游纯化过程并对相关产品成本进行了分析, 相对于传统下游纯化过程, 新型的下游纯化过程在连续加工模式时, 商业运营和临床操作相比批次加工模式能节省更多成本。Dutta等31成功利用连续逆流切向色谱方法从澄清细胞培养浓缩液中提取两种不同的单克隆抗体。Girard等32利用序贯多柱色谱法优化了单克隆抗体的纯化工艺。Hardick等33开发了利用纳米纤维吸附剂连续纯化单克隆抗体的技术。Cunha等34使用连续灌注培养结合连续浓缩和透析过滤来高效浓缩和收集人骨髓间质干细胞, 是连续生物加工概念在细胞治疗方面的成功应用之一。Klutz等35阐述了连续生物处理设
