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1、探讨MDA在运动性疲劳中的作用及Tau抗运动性疲劳机制红细胞是血液基本功能的重要组成，红细胞功能的异常直接影响到气体的运输及血液粘度，从而直接影响到机体的正常生理活动和运动能力。牛磺酸（ Taurine,Tau） 又名为牛胆酸或牛胆素，是中药牛黄的主要成分，化学名称为 2 - 氨基乙磺酸（ 2 - Amin-oethyanesulfonic acid） .国内外的学者对 Tau 的生理作用已经进行了充分的研究1,其在抗氧化、缓解运动性疲劳2 -4和调节细胞稳态5方面发挥重要作用。在剧烈运动或者大负荷长时间过度训练中，由于机体运动量加大，呼吸活动及物质代谢和能量代谢加速，自由基水平升高，自由基介
2、导的脂质过氧化速率加快，脂质过氧化过程中会产生以丙二醛（ Malondialdehyde,MDA） 为代表的许多含有 α-、β-不饱和醛酮类物质（ 也叫 TBARS） ,这些物质在机体的衰老和疲劳过程中有重要的毒副作用6 -7.Tau 作为一种抗氧化剂和自由基清除剂及其抗疲劳作用在细胞和动物水平已经有了充分的研究，结果表明，Tau 可降低剧烈运动导致的自由基水平升高8,可显著延长大鼠的游泳能力9.以往研究人员在机体的抗氧化研究中，MDA 往往只认为是氧化应激水平的指标，而忽视 MDA 本身也是导致机体运动能力下降的原因及造成机体细胞结构功能损伤的重要因素10.本研究通过比
3、较过度训练大鼠模型和喂食 MDA 大鼠，比较二者红细胞在结构上的损伤性变化，采用 Tau 保护过度训练大鼠与喂食 MDA 大鼠，通过扫描电镜观察其对红细胞形态结构的影响，其对红细胞溶血反应和膜脂流动性的影响，对红细胞膜蛋白电泳特征的影响，探讨 MDA 在运动性疲劳中的作用及 Tau在抗运动性疲劳中的可能机制。1 材料与方法1. 1 实验动物与过度训练方案40 只成年 SD 大鼠购自中南大学湘雅医学院实验动物中心，雌雄不限，体重 220 275 g.在我校实验动物房中喂养 1 周后，行力竭运动3 d（ 1 次/d） ,淘汰游泳能力最强的前5 只和游泳能力最差的后 5 只大鼠，余下 30 只随机分
4、成 6组，其中 A、B 组各 3 只，其余各组 6 只。A 组为自来水对照组，常规饲养，不加其它干预措施； B 组为 PBS对照组，常规饲养，以 PBS 代替自来水； C 组为喂食MDA 组，MDA 以 PBS 为溶剂配制； D 组为喂食 MDA +Tau 组，MDA 和 Tau 以 PBS 为溶剂配制； E 组为过度运动训练组，常规饲养； F 组为过度运动训练 + 喂食 Tau组，Tau 以 PBS 为溶剂配制。1. 2 研究方法1. 2. 1 游泳过度训练方案筛选的 30 只 SD 大鼠休息饲养 3 d 后对 E、F 组进行 4 周负重游泳过度训练，每周负重量依次为： 3% 体重、5% 体
5、重、7% 体重、9%体重，每次游泳至力竭。力竭标准为大鼠头沉入水下持续 10 s 以上，捞起后呈低头俯卧位，呼吸深急。1. 2. 2 Tau 配制、MDA 的制备Tau 溶液的配制按照参考文献9提供的方法配制。先将 Tau 溶解于 1N 的盐酸中，然后用1N 的 NaOH 中和到 pH 7. 0 后，过滤除菌，最后用 PBS 配制成浓度为 10% 的 Tau 溶液。Tau喂食剂量为每 100 g 大鼠体重 10 mg（ 即每 100 g 体重大鼠喂食 1 mL） .MDA 的制备按照文献11提供的方法配制，用 TMP 制成 10 mM 浓度的 MDA,喂食剂量为每 100 g 大鼠 1 mL.
6、1. 2. 3 仪器和试剂主要仪器有日本日电 JSM -2840 型扫描电镜，日本 Hitachi F - 4500 型荧光分光光度计，美国 Bio-Rad 5070 型通用电泳仪。主要试剂有1,1,3,3 - 四甲氧基丙烷 （ 1,1,3,3 - tetramethoxypro-pane,TMP） ,DTT（ 1,4 - dithiothreitol） ,DPH（ 1,6 - di-phenyl - 1,3,5 - hexatriene） ,四氧化锇（ osmium tetrox-ide） 购自 Sigma 公司； 蛋白裂解试剂盒购自上海润城生物科技公司； Tris,TEMED,SDS,Gl
7、y 等电泳用常规试剂购自 Amresco 公司，其它试剂购自上海生工生物工程公司；1. 2. 4 红细胞扫描电镜观察样品的制备处死大鼠从腹主动脉处收集全血，全血用10 倍体积的生理盐水洗涤后，2 000 r/min 离心去上清，重复 2 次即得压积红细胞，圧积红细胞加入到含 3% 的戊二醛的甲次砷酸盐的缓冲液（ pH7. 4） 中固定至少 1 h 后，植入预先包被有多聚赖氨酸的玻片，经 1% 的四氧化锇固定后，乙醇梯度脱水，CO2临界点干燥后于扫描电镜下观察。1. 2. 5 红细胞膜的制备红细胞膜按照依照 Dodge等的方法制备12.红细胞加入到在冰箱中预冷的生理盐水中（ 1: 9 体积比）
8、,离心（ 2 000 r/min,5 min） 洗涤 3 次后，按照红细胞与双蒸水体积比 1: 9 的比例低渗裂解红细胞，置 4 冰箱中 3 h 后，离心（ 6 000 r/min,10 min） ,去上清，用双蒸水离心洗涤 4 5 次后，直到收集的红细胞膜无红色。最后将收集的红细胞膜悬浮在 pH7. 4 的 PBS 缓冲液中备用。1. 2. 6 红细胞膜流动性的测定制备的红细胞膜按照按 Lowry 法13测定膜蛋白浓度，用 PBS 配成红细胞膜悬液（ 膜蛋白浓度在 300 350 mg/L） .取红细胞膜悬液 2. 0 mL 加入含 DPH 浓度为 2. 0 × 10- 6mol
9、 / L 的PBS 2. 0 mL,在 25 水浴 30 min 后，以激发和发射波长分别为 360 nm 和430 nm 测定计算各组荧光偏振度（ P） ,P = （ Ivv-G × Ivh） / （ Ivv+ G × Ivh） ,G 为校正因子，G= Ihv/ Ihh.其中 Ivv为起偏器和检偏器为垂直时的荧光强度； Ivh为起偏器为垂直和检偏器为水平时的荧光强度； Ihv为起偏器为水平和检偏器为垂直时的荧光强度； Ihh起偏器和检偏器为水平时的荧光强度度。荧光偏振度（ P） 与微粘度（ η） 的定量关系14: η = P/（ 0. 46 - P）
10、.膜流动性用膜微粘度表示，膜微粘度越大，流动性越小。微粘度变化的数据为每组各动物 3次所测结果的平均值。1. 2. 7 红细胞溶血度的测定各处理组红细胞溶血度的测定参照文献15的方法。即取各处理组大鼠血清，用分光光度法在 415 nm 处测定其吸光度； 正常大鼠压积红细胞放入 37 蒸馏水中（ 体积比为 1 1） 1 h后，离心取上清，用分光光度法测定该上清吸光度。用红细胞在蒸馏水中溶血后吸光度（ 假设这时红细胞的溶血度为 100%） 作对比算出各处理组红细胞的溶血度。各处理组红细胞溶血度变化的数据为每组各动物 3 次所测结果的平均值。1. 2. 8 红细胞膜蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（
11、SDS-PAGE） 按照 Laemmli 法进行16,即取红细胞膜样品，经裂解后释放膜蛋白，用 PBS 缓冲液稀释到上样蛋白浓度为 1. 0 mg/mL （ Lowry 法定量） .以7. 5% 的丙烯酰胺胶浓度，150 V 恒压 60 min 电泳后终止。凝胶以考马斯亮蓝（ R -250） 染色显带。1. 2. 9 数据分析本研究中给出的所有数据为平均值 ± 标准差。不同组间的比较采用 SPSS13 统计软件进行方差分析（ ANOVA） ,并用 Origin7. 5 软件进行统计绘图。P 0.05 代表统计学上有显著差异，P 0. 01代表统计学上有极显著差异。2 结 果2.
12、1 各不同处理组红细胞扫描电镜观察红细胞在受到环境异常刺激后，会出现各种不同异常形态。各处理组红细胞按要求制备成样品后，在扫描电镜下观察红细胞的形态。结果如图 1（ 80 000 倍放大） .显然，丙二醛和过度训练导致了大鼠红细胞形态的异常，而 Tau 对红细胞形态的破坏有保护作用。图 A、B 为分别用自来水和 PBS 喂食的大鼠红细胞，形态上为典型的双凹圆饼状； 图 C 为喂食 MDA 大鼠的红细胞，部分红细胞出现异常结构； 图 D 为喂食Tau 和 MDA 大鼠红细胞，基本上为结构异常的红细胞，少量红细胞周围出现毛刺； 图 E 为过度训练大鼠红细胞，不仅结构异常，还出现聚集现象； 图 F
13、为过度训练大鼠同时喂食 Tau 后的红细胞，结构大多完整，且为双凹圆饼状。2. 2 各不同处理组大鼠红细胞膜流动性的变化红细胞膜的流动性是红细胞发挥其运载功能的重要生理基础。红细胞膜的流动性以红细胞膜的微粘度来表示，红细胞膜微粘度升高，表明其流动性降低，红细胞变形性下降，是红细胞膜受损的重要指标。各不同处理组大鼠红细胞微粘度 η 的变化如表 1 所示。与对照组（ A 和 B） 比较，其余各不同处理组大鼠红细胞微粘度升高，流动性降低，且都表现出显著或极显著差异。C 组大鼠喂食 MDA 后导致红细胞微粘度升高，流动性降低，与同时喂食 MDA 和 Tau 的 D 组大鼠比较，D 组大鼠红细胞
14、膜微粘度降低，流动性升高，它们之间存在显著差异（ #P 0. 05） ; E 组大鼠在剧烈运动后其微粘度升高，与剧烈运动同时喂食 Tau的 F 组比较，后者的微粘度降低，细胞膜流动性升高，它们之间也表现出了显著差异（ %P 0.05） .2. 3 各不同处理组大鼠红细胞溶血度的变化在红细胞处于应激状态下，红细胞膜的结构会发生改变，导致膜的完整性变差，红细胞膜容易破裂导致红细胞易于溶血。各不同处理组大鼠红细胞的溶血度变化如表 2 所示。与对照组（ A 组和 B 组） 比较，各种不同处理都导致红细胞溶血度升高，但不管是喂食 MDA 组后再喂食 Tau（ C 组与 D 组比较） 或力竭运动后再喂食
15、Tau（ E组与 F 组比较） ,都可显著降低红细胞的溶血度，显示Tau 能拮抗 MDA 或力竭运动所致的红细胞膜的损伤。2 4 各不同处理组大鼠红细胞膜蛋白凝胶电泳结果为进一步研究各不同处理对大鼠红细胞膜蛋白的影响，用生理盐水洗涤各组的压积红细胞后，按12 5 的方法制备红细胞膜，红细胞膜用蛋白裂解试剂盒裂解后，经 SDS-PAGE 凝胶电泳，结果如图 2 所示。泳道 1 6 分别为 A F 组大鼠红细胞膜蛋白在 SDS-PAGE中电泳的行为，泳道 1 和2 没有出现新的电泳条带，而其它各处理组都出现了高分子量聚集的新电泳条带( high molecular weight aggregation，HMWA) ，说明各种不同的应激都将导致红细胞膜蛋白结构的变化。3 讨 论MDA 作为自由基介导的脂质过氧化和非酶糖基化过程所产生的 α-、β-不饱和醛酮类物质的代表性中间产物17,其对机体正常生理功能和稳态的
