对心脏成纤维细胞是否在表型上具有多样性的研究摘要：目的 探讨心脏成纤维细胞 （CFs） 生物表型多样性方法 新生13天SD大鼠12只， 胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新60只生大鼠CFs, 比较原代和传代培养细胞形态学变化， 免疫组织化学学检测鉴定常见成纤维细胞标记波形蛋白 （vimentin） 、成纤维细胞特异性蛋白1 （FSP1） 和盘状结构域受体 （DDR2） 的表达， 细胞免疫荧光检测CFs干细胞标记nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90的表达， 细胞免疫荧光三标技术检测CFs干细胞标记间的共表达情况结果 酶联合消化法分离培养的CFs收获细胞量大， 第3代细胞活力好、纯度高Vimentin、FSP1和DDR2在CFs中均表达， 但DDR2在CFs中呈强表达部分CFs分别表达nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90, 部分nanog阳性的CFs分别和CD73、CD90和sca-1, 及其CD90和sca-1存在共表达， nanog+/CD73+共表达阳性率最高 （59.02%±8.39%） , 与其他3组相比差异均有极显着性 （P0.05） , 但这两组与CD90+/sca-1+相比差异均有极显着性 （P 0. 05） . And the rate of nanog+/CD90+and nanog+/sca-1+ had extremely significant different with the rate of CD90+/sca-1+ （ P 0.05） , 但这两组与CD90+/sca-1+相比差异均有极显着性 （P<0.01） ;CD90+/sca-1+共表达CFs阳性率均低于其他3组 （29.35%±3.7%vs59.02%±8.39%, 43.55%±3.92%, 43.78%±10.88%） , 差异具有极显着意义 （P<0.01, 图5） . 讨论 CFs是心脏中数量最丰富的一种间质细胞， 分布广泛， 增殖迅速。
其主要功能是合成和分泌细胞外基质 （extracellular matrix, ECM） , CFs与ECM共同构成复杂而精妙的三维网络结构， 支持并连接心肌细胞， 调节心肌细胞机械、电生理活动， 在心脏正常发育和病理性损伤修复中发挥重要作用[8,9]. 目前， 成纤维细胞尚缺乏特异性表面标记， 对成纤维细胞的鉴定也存在诸多争议只有确保成纤维细胞鉴定准确后， 才能保证对其研究的精准性Vimentin是最常见的成纤维细胞分子标记， 但该蛋白也可标记内皮细胞和神经元[10];FSP1曾经被认为是成纤维细胞的特异性标记， 但淋巴细胞和肿瘤细胞也呈阳性表达[11];DDR2也可标记成纤维细胞， 但白细胞和肿瘤细胞中也有表达有研究显示， 在心脏组织中， 心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中未检测到DDR2表达[12].本研究对体外分离培养新生大鼠CFs, 采用免疫组织化学分别检测vimentin、FSP1和DDR2表达根据我们先前的研究认为， 除了根据以上这些标记物作为鉴定成纤维细胞之外， 还应该结合细胞来源、形态、分布等特征进行判断， 比如来自正常心肌组织的成纤维细胞不可能含有肿瘤细胞另外， 根据细胞的形态特点可以明确地区别于心肌细胞 （有横纹） 和白细胞等[13].综合分析， 本研究采用3种标记综合判断， 筛选出的成纤维细胞纯度是达标的、可信的。
CD90为一种细胞表面黏附分子， 在细胞的黏附、凋亡、增殖和迁移等信号转导中发挥重要作用有研究证明， 体外分离培养肺成纤维细胞中存在CD90+和CD90-亚群， 它们在炎症反应和纤维化进程中发挥不同作用[14].Rege等[15]证实， CD90+成纤维细胞更易转化为肌成纤维细胞 （myofibroblast, MFB） .心肌球来源 （cardiosphere-derived cells, CDCs） 的CD90-细胞在心肌梗死模型中则具有更大的修复潜能[16].Ali等[17]证实， Thy1+、CD45-、CD31-、CD11b-、Ter119-是心肌成纤维细胞中的主要亚群 C-kit又称CD117, 酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一， 是干细胞因子 （stem cell factor, SCF） 的受体， 它与SCF结合作为重要的受体配基复合物， 通过激活下游信号分子复合物， 产生强大的连锁反应， 从而在细胞分化、增殖中发挥重要作用[18].与c-kit类似， 干细胞抗原1 （stem cells antigen-1, sca-1） 也是一种造血干细胞标记物， 在调控造血干细胞和c-kit表达中发挥重要作用[19].移植分离培养心脏sca-1+/CD31-可实现对心肌梗死损伤的有效修复[20].nanog是一种胚胎干细胞转录因子， 在维持干细胞多能性中发挥重要作用， 调控基因的转录并保持干细胞的未分化状态[21,22].CD73在细胞生长发育、纤维蛋白合成及免疫应答等方面均发挥重要作用[23], Boiret等[24]证实， CD73在细胞增殖方面具有一定的促进作用。
前期我们研究发现， 表达nanog蛋白的心脏成纤维细胞可能更具有干细胞样特性[13], 且nanog在CD73+脂肪间充质干细胞 （adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs） 中呈现强阳性表达[25], 且CD73+ADMSCs具有更强的向心肌分化能力[26]. 为比较CFs在干细胞表达方面差异， 结合我们前期工作基础， 细胞免疫荧光对nanog、c-kit、sca-1、CD90和CD73表达情况进行分析， sca-1+所占比例最大， 其次为nanog+, 而c-kit、CD90和CD73阳性细胞所占比例下降为检测CFs是否存在干细胞标记的共表达现象， 采取细胞荧光三标技术进行观察分析结果显示， nanog+/CD73+共表达阳性率最高， 与其他3组相比差异均有极显着性；而nanog+/CD90+共表达CFs阳性率与nanog+/sca-1+之间差异没有显着性， CD90+/sca-1+共表达CFs阳性率均低于其他3组， 差异具有极显着意义虽然这些干细胞标记物在成纤维细胞的表达存在差异， 但足以提示成纤维细胞具有显着的干细胞特性， 且干细胞标记存在重叠性表达现象， 至于它们在细胞增殖、心肌分化、心肌损伤修复等过程中的具体作用， 有待进一步探讨。
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