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1、人参根际土壤拮抗性放线菌的筛选、分离和鉴定人参为五加科人参属多年生宿根性植物，是我国传统名贵中草药，有百草之王;的美誉。人参主要分布于东三省，其中，吉林省长白山区是人参的主产区，产量达全国总产量的 70%-80%。人参病害是影响人参产量与质量的一个重要因素。目前，在人参中发现的侵染性和非侵染性病害有 50 余种，我国已报道的有 30 余种。其中，立枯病、黑斑病、锈腐病、根腐病、疫病、菌核病及灰霉病是人参 7种主要真菌性病害。常年发病率在 10%-30%，严重时达到 60%-70%，甚至绝收。目前，对人参病害防控主要依靠化学农药。化学农药防治人参病害虽然是很有效的方法，但是，长期使用化学农药不仅
2、导致农药残留和环境污染，并且易诱导病原微生物产生抗药性。开发环境友好的生防制剂成为替代化学农药的重要措施。生物防治是以生态学原理为基础，利用生物物种间的相互作用，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物。生物防治最大的优点是不污染环境，无农药残留，这是化学农药等非生物防治措施无法比拟的。利用拮抗微生物防治病原微生物是生物防治技术的重要组成部分。放线菌因其来源广泛，代谢产物活性较高等引起广泛关注，其拮抗机制和作用主要有抗生作用、竞争作用和重寄生作用。放线菌能够产生抗生素、有机酸、甾体化合物及酶的抑制剂等多种生物活性物质，对植物病害产生抑制或杀灭作用。目前，在人参生产中，使用的放线菌生防制剂还较少，
3、而且均来源于农作物，无人参专用生防制剂。为此，本研究对人参进行根际土壤拮抗性放线菌的筛选、分离和鉴定研究，旨在为开发人参专用放线菌制剂提供科学依据。1、材料与方法1.1 材料1.1.1 供试病原菌 引起人参的根腐病、锈腐病、疫病、菌核病、灰霉病、黑斑病和立枯病的主要病原真菌，分别是腐皮镰孢菌（Fusarium solani）、毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）、 恶疫霉菌（Phytophthora cactorum）、 人参核盘菌（Sclerotiniaginseng）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）人参链格孢菌（Alternaria panax
4、）、立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani），均由吉林农业大学农学院植物病理教研室提供。1.1.2 土壤样品 来源于吉林省抚松县万良镇不同年限人参栽培基地土壤，风干过 40 目筛。1.1.3 主要培养基 高氏一号培养基 ；马铃薯葡萄糖（PDA）培养基 ；ISP2 液体培养基 ；形态学观察和生理生化培养基。1.1.4 主要试剂 TaKaRa MiniBEST Bacterial Geno-mic DNA Extraction Kit Ver.2.0 试剂盒 ；放线菌 16SrDNA 序列扩增引物 8-27f ：5 -AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3 ，1523-1504r
5、：5 -AAGGAGGTGATCCAG-CCGCA-3 由长春联星生物技术有限公司合成。1.2 方法1.2.1 土壤放线菌的分离 称取土样 10 g，放入装有玻璃珠和 90 mL 无菌水的三角瓶中，28 180 r/min充分振荡 30 min，使样品与无菌水混合均匀，制得样品悬液。在无菌条件下取 1 mL 样品悬液加入 9mL 无菌水，制得 10-1稀释液，以此类推按梯度依次制成 10-3、10-4和 10-5的稀释液。分别吸取各梯度稀释液 100 μL，在高氏一号平板上采用平板稀释涂布法分离放线菌菌株，28培养 10 d。根据菌落形态、颜色、边缘，可溶性色素等特征挑取放线菌，进行平板
6、划线纯化，将纯化获得的菌株编号，4保存备用。1.2.2 拮抗放线菌的筛选 采用平板对峙法进行初筛。在 PDA 培养基中心分别接入 1.1.1 中的人参病原菌菌饼（Φ=5 mm），将用打孔器打好的直径 5mm 放线菌菌饼置于距病原菌 25 mm 两侧，每个处理重复 3 次，置于 25培养箱暗培养，观察是否产生抑菌圈，定期观察、测量抑菌圈的大小，挑选抑菌效果好的菌株进行复筛。拮抗放线菌的复筛。采用滤纸片法测定分离的放线菌对人参病原菌的抑制作用，在 PDA 培养基中心接入 7 mm 人参病原菌，将 4 片直径为 1 cm 的灭菌滤纸片置于距病原菌 25 mm 处的 4 个点上。将 7mm 的
7、放线菌菌饼接入装有 50 mL ISP2 培养基的三角瓶中。28，180 r/min 条件下振荡 4 d，每 100 μL点接到 4 片滤纸圆片上，每个处理重复 3 次，对照为不加滤纸片的病原菌平板，置于 28培养箱培养，待对照组菌落长满平板，测量处理菌落直径。抑菌率（%）=（对照病原菌直径 - 处理病原菌直径）/ 对照病原菌直径 ×100%拮抗放线菌发酵液对人参病原真菌的抑制作用：采用菌丝生长速率法，发酵上清液的制备参考林福呈等方法，将发酵上清液与 PDA 培养基按110 的比例混匀，倒入培养皿中。待培养基凝固后，在每个培养基平面接入 1 个供试真菌菌饼（直径 7mm），使
8、带菌丝一面贴在培养基表面。以加入相同比例无菌水的 PDA 平板上生长的病菌作为对照，每个处理重复 3 次，置于 28培养箱培养，待对照组菌落长满平板，十字交叉法测量处理菌落直径，计算抑菌带宽度。1.2.3 菌株的生长曲线的绘制 采用比浊法测定。将放线菌菌饼接种于 ISP2 培养基中，28条件下180 r/min 振荡培养，每隔 6 h，通过紫外分光光度计测定波长 600 nm 下的吸光值，判断放线菌生长状况。1.2.4 菌株的分类鉴定1.2.4.1 菌株形态学观察 采用插片法，并参照张纪忠等方法进行观察 ：挑取菌种培养物在高氏一号平板上划线接种。在无菌条件下，用镊子将灭菌的盖玻片以大约 45
9、角插入琼脂内。将插片平板倒置，28培养，分别在 7、15 和 30 d 时镜检观察，记录气生菌丝，基内菌丝和可溶性色素的颜色变化，取成熟时期颜色作为定种依据。1.2.4.2 菌株的培养特征和生理生化特性 参考李文均等方法，并结合伯杰细菌鉴定手册，链霉菌鉴定手册进行鉴定。1.2.4.3 细胞壁化学成分分析 采用快速薄板层析法（TCL）对 4 株放线菌的细胞壁化学类型及全细胞水解物糖型的进行分析。1.2.4.4 放线菌总 DNA 的提取按照 TaKaRaMiniBEST Bacterial Genomi cDNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒的说明书进行 DNA 的提取。1.
10、2.4.5 16S rDNA 序列的扩增 以总 DNA 为模板，8-27f 和 1523-1504r 作为引物扩增 16S rDNA 序列。反应体系 ：Premix ExTaq10 μL，10 mmol/L ForwardPrimer 0.6 μL，10 mmol/L Reverse Primer 0.6 μL， 模板 2 μL，补充 H2O2至 20 μL。PCR 反应条件 ：94变性 5 min ；94变性 40 s，56退火 40 s，72延伸 90 s，35 个循环 ；72延伸 5 min。PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物送上海生物
11、工程技术服务有限公司测序。将测序得到的序列与GenBank 中的核酸序列进行比对分析，从 GenBank中检索同源性高的菌株用于系统发育分析，利用MEGA5.0 的 Neighbor-Joining 法构建系统发育树，并计算株间 16S rDNA 序列的相似性。2、结果2.1 土壤放线菌的分离及活性菌株的筛选从人参根际土壤中分离得到放线菌菌株 206 个，经过平板对峙法筛选出 36 株对人参真菌性病害有抑制作用，其中编号为 FX-10、FX-61、FX-137 和FX-139 的 4 个菌株对供试 7 种人参病原真菌具有较强的抑制作用。FX-10 对毁灭柱孢菌、灰葡萄孢菌和 FX-61 对人参
12、核盘菌的抑制率分别达到 91.28%、91.8% 和 90.07%，具有显著的抑制作用（表 1）。4株放线菌均对人参核盘菌表现出最强的抑制作用，其平均抑制率为 88.59% ；对灰葡萄孢菌的平均抑制率为 75.37% ；对恶疫霉菌的平均抑制率为 71.43% ；仅 FX-139 菌株对立枯丝核菌有抑制作用，抑菌率为78.22% ；而 FX-137 对腐皮镰孢菌无抑菌作用，对人参核盘菌的抑菌效果最好，抑菌率达 84.40%（表 1）。2.2 拮抗放线菌发酵液对人参病原真菌的抑制作用菌株 FX-139 发酵上清液对人参菌核病菌无抑制作用，对人参锈腐病菌和人参黑斑病菌的抑菌带为6.0 mm，对人参根
13、腐病菌的抑菌带为 9.7 mm，抑制率较好。对人参疫病菌的抑菌带为 14.3 mm，对人参立枯病菌的抑菌带为 11.9 mm，对人参灰霉病菌的抑菌带为 11.4 mm，体现了明显的抑制效果，其他菌株的抑菌谱见表 2。2.3 菌株的生长曲线的绘制接入 FX-139 菌块之后的 6-12 h，菌体的生长量稍有下降，18-24 h 处于一个缓慢增长的趋势，从24-30 h，菌体处于对数期，菌体以几何数增加，增长速度快 ；细胞代谢旺盛 ；从 30-60 h 菌体生长处于稳定期，生长速率下降，死亡率上升，菌体数量处于一个动态平衡状态，是获得次级代谢产物的重要时期。72 h 后由于培养基内生存条件急剧恶化
14、，导致菌体的增值速度小于死亡速度，此时菌体的数量急剧下降，其他菌株的生长曲线见图 1-图4。2.4 菌株的鉴定2.4.1 菌落形态特征及培养特征的观察 菌株 FX-139 的菌落边缘整齐，稍突起。菌株 FX-139 在高氏一号培养基上生长良好，孢子卵圆形，表面光滑。基内菌丝分支少、直、无横隔，无断裂。气生菌丝直，生长旺盛，头部紧密螺旋形（图 5）。其他菌株的形态学特征见表 3。2.4.2 菌株的生理生化特性 菌株 FX-139 在不同培养基上气生菌丝呈白色，灰色，淡紫褐色或浅黄色，基内菌丝分别为白色、豆沙色、粉白色、浅黄色或灰色，在各种培养基上均无可溶性色素产生。菌株 FX-139 能使明胶液
15、化、淀粉水解、硝酸盐还原，产生 H2S，不能使牛奶凝固与胨化不产酸不产碱，能在纤维素滤纸上生长但不能分解纤维素，不产生黑色素。能较好地利用葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、棉籽糖，对果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、麦芽糖的利用能力较差。最适生长温度为 30，pH值为 4.4-10.4，最适 pH 为 7.4，具有耐盐性，耐盐范围为 1%-10%。其他菌株培养特征及生理生化指标见表 4 和表 5。2.4.3 四株放线菌细胞壁化学成分的分析 4 株放线菌细胞壁化学成分均含 L，L-二氨基庚二酸及甘氨酸，化学型属于 I 型 ；全细胞水解液无特征性糖，糖型为 C 型，符合链霉属的化学分类特征。2.4.4 16S rDNA 序列分析与系统进化树构建序列分析表明，FX-139、FX-137、FX-61 和 FX-10 长度分别为 1 373、1 442、1 404 和 1 439 bp，GenBank 登录号分别为 KF782840、KF782839、KF7828
