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1、酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。酵母蔗糖酶分子量约 270000D，pI 约 50，最适 pH46，耐酸和热，50保温30min 仍具有相当的活力，最适温度 37。耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。加热纯化。乙醇分级沉淀。纤维素柱层析分离纯化。、前三步分离纯化的原理如下：甲苯 石英砂 离心 上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞 破细胞 中层（水层）：蔗糖酶
2、，可溶性糖等研磨 下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等取中层 50 水浴中 使热不稳定蛋白变性 离心 上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层） 保温 30 分钟 沉淀：变性蛋白取上清 加乙醇 使蔗糖酶沉淀 离心 上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中 20 分钟 沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等、纤维素柱层析分离纯化的原理1、 离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。离子交换层析是一种液-固相层析技术。其中，
3、液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如 DEAE 纤维素、强碱型的离子交换树脂等。反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如 CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。离子与交换剂的静电结合作用具如下特点： 选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。 + 遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大， 则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行 可逆性：在一定条件
4、下，结合在交换剂上的离子可被其它 + （溶液中离子） 离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。 由于离子与交换剂的结合具有上述特点，因此如混合物 阴离子交换剂中的各组分具有不同的电荷性质，或虽然电荷性质相同，但电荷数不同，则各组分与离子交换剂的静电结合能力就不同。与交换剂上带电基团电荷性质相反，带电荷数目越多的离子越容易吸附在交换剂上，带电数目越少，结合能力越弱。如离子所带的电荷与交换剂上带电基团的电荷性质相同，则完全不能结合于交换剂上，经洗脱液洗脱后，各组分即按离子结合能力由小到大的顺序依次洗脱出来，从而达到分离混合物的目的。当用离子交换层析分离生物大分子如蛋白质、核酸时，由于生物大分子（
5、蛋白质）常为两性电解质，在不同的 pH 条件下，组成蛋白质的 AA 解离情况不同，导致蛋白质具有不同的电荷性质和电荷数目，因此可通过调节溶液的 pH，使待分离的蛋白质混合物选择性地吸附于离子交换剂上，再通过改变洗脱液的离子强度和 pH，控制这种结合能力，从而使蛋白质混合物按结合能力由小到大的顺序依次从层析柱中洗脱下来。本试验用 pH73 的 Tris-HCl 缓冲液进行洗脱，在该条件下（高于酶的等电点） ，酵母蔗糖酶带负电荷，因此当用阴离子交换剂（DEAE-纤维素）进行分离时，酵母蔗糖酶结合于离子交换剂上，通过改变洗脱液中盐浓度的方法即可将酵母蔗糖酶洗脱下来。2、 离子交换纤维素柱层析的流程、
6、离子交换纤维素的准备即将离子交换纤维素变成适于分离各类离子的形式，主要包括以下几步处理：a、除去交换剂中的杂质和使纤维素溶胀通常用 05N 的 HCl 和 05N 的 NaOH 处理，对阳离子交换纤维素先用 NaOH 洗，然后用 HCl 洗。对阴离子交换纤维素则相反。处理时间每次均为 30min，每次洗涤后，均要用大量水洗至中性。通过此步，一方面可除去牢固吸附在纤维素上的杂质，另一方面可使纤维素充分膨胀，从而使交换剂的带电基团更多地暴露在溶液中。B、除去纤维素中的细粒，否则影响流速。C、转型：即用适当的平衡离子平衡，从而使交换剂带上所希望的离子。但在实际应用中，此步常用起始缓冲液平衡。、洗脱缓
7、冲液的选择a、缓冲溶液 pH 的选择：决定于被分离物质的等电点、稳定性和溶解度及纤维素上交换基团的解离常数（pK 值）。若分离的目的物属酸性物质，用阴离子交换剂时，缓冲液要用高于该物质等点电的 pH 值，并且此 pH 值应低于该纤维素的 pK 值。反之若目的物属碱性物质，用阴离子交换剂时，则缓冲液应选用低于该物质等电点的 pH 值，并且此 pH 值应高于该纤维素的 pK 值。b、缓冲液的离子种类及离子强度：由于纤维素的交换容量小（0409 毫克当量/g ） ，为降低盐离子的竞争，起始缓冲液的浓度应尽可能低（0001001M） ，当确认该物质能被吸附后，可适当提高离子强度，以提高缓冲能力。缓冲液
8、的离子应不影响被分离物质或干扰其活力的测定，也不应影响被测物质的溶解度或与一些必要的保护剂（Ca 2+、Mg 2+等）发生沉淀。洗脱液的梯度应可单纯增加缓冲液的离子浓度，但并不影响缓冲液的 pH。、层析柱的选择柱床体积至少要比束缚所有样品所需要的大 25 倍，柱的形状一般以直径与高度之比为 1：15 为好。a、当采用阶段洗脱时，不能用过长的柱，否则区带扩散较宽，降低分辨率，即应用直径与高度之比较高的柱。此时，如必须增加离子交换剂的体积，则应增加柱的直径。b、当采用连续梯度洗脱时，则增加柱长能增加分辨率，但此时流速不能过快。、装柱柱装的好坏对层析效果影响很大，对装柱的要求是，交换剂在柱中分布要均
9、匀，严防有节和气泡产生，沉积表面要平。、柱的平衡即用起始缓冲液充分洗涤柱床，已达到所需的 pH 及离子强度，以免在层析中发生 pH的变化。当达到充分平衡时，流出液和起始缓冲液的 pH 和电导度均应相同。此步的另一目的还在于使柱床体积稳定下来即柱高不变和保持洗脱液流速的恒定。洗脱液流速的恒定可通过调节操作压或调节流出口内径的大小来控制，增大操作压或加大流出口内径，流速均加快。洗脱液合适流速的确定应根据实际情况而定，如果流速太快，则分辨率降低，每种物质的洗脱峰都要被其它物质所污染。如果流速太慢，则洗脱峰会扩散。、上柱样品的准备与量的大小样品应与起始缓冲液具有相同的和离子强度，上柱前样品应离心除去不
10、溶物，否则容易将柱堵住。上样量的大小取决于试验目的、样品中所要物质的浓度以及它对交换剂的亲和力。当所要物质在样品中含量很低，但对交换剂亲和力很大时，可以将几倍于柱床体积的样品通过柱，直到该成分饱和为止，然后再进行洗脱。当要求高分辨率时，加样时紧密吸附的区带不应超过柱床体积的 10%。阶段梯度洗脱时，加样量可相应大一些，因为此时解吸和再吸附的过程是不重要的，但紧密吸附的区带也不应超过柱床体积的一半。加样时注意不要把床表面破坏，否则层析区带会不整齐。如有破坏，可搅起数毫米交换剂，使其自然沉降平正为止。、洗脱梯度的形状和吸脱液量的大小吸脱液体积（相对于柱床体积而言）的大小和吸脱梯度的形状（盐浓度的变
11、化能力）对柱的分辨率影响极大。洗脱可以用恒定组成的起始缓冲液来完成（简单洗脱） ，也可以用改变 pH 或盐浓度、或二者均改变的洗脱液来完成。 pH 和盐浓度的改变又分为连续改变（梯度洗脱）和不连续改变（阶段洗脱） ，由于 pH 的改变对生物大分子活性的影响很大，因此实际应用中常采用改变盐浓度来进行洗脱。阶段洗脱在大量制备时用得较多，这种洗脱方式只有在对所要分离的离子在给定的离子交换剂上的行为了解得很清楚的情况下才能使用。由于采用梯度洗脱可大大提高分辨率，因此实际分离中，常采用连续梯度洗脱。一般常用约 5 倍柱床体积的洗脱液进行线性梯度洗脱，增加洗脱液的总体积（即降低梯度的斜率） ，可使分辨率提
12、高，但同时会使洗脱区带加宽，使洗脱下来的样品浓度较稀。如减少洗脱液的总体积，则可增加梯度的斜率，使洗脱峰显著变尖，洗下来的样品浓度较高，但分辨率相对变低。、柱的洗脱与收集选定了合适的洗脱液即梯度形状后，柱洗脱的主要问题就是流速了。洗脱速度与所用交换剂的种类关系极大。选择柱的流速要注意两件事：a、离子吸附到离子交换剂上的速度应比它们从交换剂上脱附的速度慢得多，因此，加样时，样品上到离子交换剂上的速度应比洗脱它们所用的速度慢的多。b、流速与实际测定的最适流速偏离越大，则柱的分辨率降低得越多。流速太快，分辨率降低，流速太慢，则洗脱峰扩散。c、洗脱下来的样品常用部分收集器收集在试管中，一般每管收集 3
13、10ml，降低每管收集的量，不能增加柱的分辨率，但却能充分表达出整个柱的分辨率。测定每管的蛋白浓度和酶或离（或其它活力） ，确定各峰的位置，根据测得的数据作层析图谱。、纤维素的回收产物浓度 、绘制洗脱图谱三、蔗糖酶活力的测定原理蔗糖酶蔗糖 葡萄糖 + 果糖 (G 和 F 都具半缩醛羟基，该半缩醛羟基可被pH4555 氧化为羧基，这样的糖称还原糖)OH -还原糖 + 3，5-二硝基水杨酸 糖酸 + 3-氨基-5 硝基水杨酸 （棕红色，540nm 处具特征光吸收，OD 值与还原糖含量成正比，可据此进行比色测定）蔗糖酶活力单位定义：一定条件下（37） ，一分钟内能产生 1mg 还原糖的酶量。四、福林
14、酚试剂法测定蛋白质含量的原理详情参见相关文档五、蔗糖酶动力学性质的测定原理1、反应进程曲线的制作和初速度的测定酶促反应速度（v）：指单位时间，单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。本试验以单位时间、单位体积中产物的增加量来表示酶促反应速度。如将产物浓度对反应时间作图，即可得到酶促反应的进程曲线，如图：图中曲线的斜率即为酶促反应速度。 由图可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随反应时间的延长，酶促反应速度下降。下降的原因：底物浓度降低，酶在一定的 pH 及温度下部分失活；产物对酶的抑制；产物浓度增加而加速了逆反应的进行等。2、 底物浓度对酶促反应的影响（Km，Vmax 的测定）在其它条件不变的情况下，底物浓度与酶促反应速度的关系如下： 时间Vmax s 1 V= v Km + s
