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1、倒地铃种子超低温保存技术规程1 范围本标准规定了倒地铃（Cardiospermum halicacabum L.）种子超低温保存过程中的术语和定义、保存种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于倒地铃种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1倒地铃
2、Cardiospermum halicacabum L.为无患子科（Sapindaceae）倒地铃属（Cardiospermum）草质攀援藤本，全株可做药，味苦、辛，性寒，具有清热、利尿、凉血、去瘀、解毒等功效。收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂.第九册。3.2倒地铃果实 Cardiospermum halicacabum L. fruits果实为蒴果，梨形、陀螺状倒三角形或有时近长球形，高1.53 cm，宽24 cm，褐色，被短柔毛。3.3倒地铃种子 Cardiospermum halicacabum L. seeds倒地铃的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子黑色
3、，有光泽，直径约5mm，种脐心形，鲜时绿色，干时白色。3.4种子超低温保存 seed of cryopreservation 指将经过前处理的倒地铃种子置于液氮（-196）中保存。4 保存种子的选择4.1 果实采收8月至12月，由果皮由绿色变褐色时，即可采收，去除果皮，取出种子。4.2 种子选择去除果皮，挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4 冰箱中保存备用（存放时间不超过2 个月）。5 种子前处理5.1 生活力检测参照植物生理学实验指导中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定倒地铃种子生活力。待测种子在30 35 温水中浸种2 h，随后取吸胀种子20 粒，整齐地埋于备好的琼脂凝胶中，注意要将胚埋入凝
4、胶中。将培养皿置于35 温箱中12 h后观察结果。5.2 生活力计算在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数100%待保存的倒地铃种子生活力应70%。5.3 含水量范围用尼龙网袋包裹倒地铃种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为18000:1，室温条件下干燥处理018 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由25%30%降至20%25%。参照GB/T 3543.6中的高恒温烘干法（130烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重100%。6 种子保存
5、量倒地铃种子保存量不少于500粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式倒地铃种子超低温保存的冷冻方式为玻璃化冷冻法，即将装有种子的5 mL冻存管（每管90粒种子）置于装载液（LS）中并于25 处理种子20 min，再用玻璃化保护溶液（PVS2）冰浴处理种子30 min，换上预冷新鲜的PVS2后迅速投入液氮中进行超低温保存。8 恢复培养8.1 种子解冻处理液氮中至少冻存24 h后，取出1个冻存管，立即放入40 水浴中快速解冻5 min，而后用洗涤液（DS）浸泡15 min，并用纯净水洗涤3次。8.2 冻后种子生活力检测取出45粒解冻后的种子，参照5.15.2生活力检测方法，进行超低温保存后的
6、初始生活力检测。当种子生活力60%时视为保存成功。8.3 恢复培养将剩下45粒解冻后的倒地铃种子，播种到带有无菌滤纸的发芽盒中，温度2530，湿度70%85%条件下培养。倒地铃种子出芽周期大概1535d。附录1 BTB的配制和保存方法精密称取BTB 0.1 g，溶解于煮沸过的100 mL纯水中，然后用滤纸去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，此液长期贮存于棕色瓶中。1.5% BTB琼脂凝胶：称量0.1% BTB溶液40 mL置于烧杯中，称取0.5 g琼脂，将其剪碎后加入杯中，加热并不断搅拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷却即可趁热倒入9 cm培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。2 装载液（LS）的配制及保存方法精密称取蔗糖13.7 g，称量甘油11.9 mL，溶于液体MS培养基中，并定容至100 mL，调pH至5.8，高温高压灭菌，4 冷藏。 3 玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8 mL、乙二醇13.6 mL、二甲亚砜13.6 mL，称取蔗糖13.7 g，溶于MS溶液中，定容至100 mL，调pH至5.8，高温高压灭菌，4 冷藏。注意：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。 4 洗涤液（DS）的配置及保存方法精密称取蔗糖41.1 g溶于MS溶液中，定容至100 mL，调pH至5.8，高温高压灭菌，4 冷藏。6
