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1、苍白秤钩风种子超低温保存技术规程1 范围本标准规定了苍白秤钩风（DiploclisiaglaucescensBl.）种子超低温保存过程中的术语和定义、保存种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于苍白秤钩风种子的液氮超低温长期贮藏。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.
2、1苍白秤钩风 DiploclisiaglaucescensBl.为防己科（Menispermaceae）秤钩风属（Diploclisia Miers）木质大藤本，俗称电藤。其藤茎、根及叶具有清热解毒、祛风除湿的功效，民间常用于治疗风湿骨痛、尿路感染、治毒蛇咬伤等症。收载于中华本草（1999）。3.2苍白秤钩风果实 DiploclisiaglaucescensBl. fruits苍白秤钩风其核果长圆状狭倒卵圆形，未成熟时绿色。3.3苍白秤钩风种子 DiploclisiaglaucescensBl. seeds苍白秤钩风的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子淡黄色，狭倒卵圆形，下部微
3、弯，长1.3cm3cm。3.4种子超低温保存 seed of cryopreservation 指将经过前处理的苍白秤钩风种子置于液氮（-196）中保存。4 保存种子的选择4.1 果实采收8 月，待果实呈黄红色时，即可采收，去除果肉，取出种子。4.2 种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于10 冰箱中保存备用（存放时间不超过3 个月）。5 种子前处理5.1 生活力检测参照植物生理学实验指导中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定苍白秤钩风种子生活力。待测种子在30 35 温水中浸种2 h，随后取吸胀种子60 粒，整齐地埋于备好的琼脂凝胶中，注意要将含胚部分埋入凝胶中。将培养皿置于室温（25 ）中
4、4 h后观察结果。5.2 生活力计算在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数100%待保存的苍白秤钩风种子生活力应90%。5.3 含水量范围用尼龙网袋包裹苍白秤钩风种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为2300:1，室温条件下干燥处理035 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由40%45%降至13%40%。参照GB/T 3543.6中的高恒温烘干法（130烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重100%。6 种子保存量苍白秤钩风种子保存量不少
5、于300粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式苍白秤钩风种子超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的苍白秤钩风种子放入15 mL冻存管（每管35粒种子）中，迅速投入液氮中保存。8 恢复培养8.1 种子解冻处理液氮中至少冻存24 h后，取出1个冻存管，立即放入40 水浴中快速解冻3 min。8.2 冻后种子生活力检测取出15粒解冻后的种子，参照5.15.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力75%时视为保存成功。8.3 恢复培养将剩下20粒解冻后的苍白秤钩风种子，播种到带有无菌滤纸的发芽盒中，温度25 30 ，湿度70%85%条件下培养。苍白秤钩风种子出芽周期大概25 d。附录1 BTB的配制和保存方法精密称取BTB 0.1 g，溶解于煮沸过的100 mL纯水中，然后用滤纸去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，此液长期贮存于棕色瓶中。1.5% BTB琼脂凝胶：称量0.1% BTB溶液40 mL置于烧杯中，称取0.5 g琼脂，将其剪碎后加入杯中，加热并不断搅拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷却即可趁热倒入9 cm培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。4
