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1、G B5 0 0 9.1 5 02 0 1 6 1 食品安全国家标准 食品中红曲色素的测定 1 范围 本标准规定了食品中红曲红素、 红曲素、 红曲红胺的测定方法。 本标准适用于风味发酵乳、 果酱、 腐乳、 干杏仁、 糖果、 方便面制品、 糕点、 饼干、 熟肉制品、 酱油、 果蔬 菜汁饮料、 固体饮料、 配制酒、 果冻、 薯片中3种红曲色素的测定。 2 原理 试样用无水乙醇或8 0%乙醇提取后, 经固相萃取柱净化, 采用液相色谱检测, 以保留时间定性, 外 标法定量。 3 试剂和材料 除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1
2、 甲醇(CH3OH) : 色谱纯。 3.1.2 无水乙醇(CH3CH2OH) : 色谱纯。 3.1.3 冰乙酸(CH3C OOH) 。 3.1.4 乙酸铵(CH3C OONH4) 。 3.2 试剂配制 3.2.1 乙酸-乙酸铵溶液(p H=5) : 准确称取0.7 7g乙酸铵置于1L容量瓶内, 加9 0 0m L水溶解, 用冰 乙酸调节p H=5. 0, 加水定容至1L, 混匀, 经0.4 5m微孔滤膜过滤后使用。 3.2.2 甲醇溶液(2 0%) : 量取甲醇2 0m L, 加水稀释并定容至1 0 0m L, 混匀。 3.2.3 甲醇溶液(4 0%) : 量取甲醇4 0m L, 加水稀释并定
3、容至1 0 0m L, 混匀。 3.2.4 乙醇溶液(8 0%) : 量取乙醇8 0 0m L, 加水稀释并定容至1L, 混匀。 3.3 标准品 3.3.1 红曲红素标准品(C2 3H2 6O5,C A S号:8 7 4 8 0 7 - 5 7 - 5) , 纯度9 9.0%。 3.3.2 红曲素标准品(C2 1H2 6O5,C A S号:2 1 5 1 6 - 6 8 - 7) , 纯度9 7.0%。 3.3.3 红曲红胺标准品(C2 3H2 7NO4,C A S号:1 2 6 6 3 1 - 9 3 - 4) , 纯度9 9.0%。 3.4 标准溶液配制 3.4.1 红曲红素、 红曲素、
4、红曲红胺混合标准储备溶液: 分别准确( 精确至0.0 1m g) 称取红曲红素 0.2 5g、 红曲素2.5m g、 红曲红胺5.0m g于5 0m L小烧杯中, 加甲醇溶解, 用甲醇转移到5 0m L容量瓶 G B5 0 0 9.1 5 02 0 1 6 2 中, 定容, 混匀, 于4保存, 其中红曲红素质量浓度为50 0 0g/m L、 红曲素为5 0g/m L、 红曲红胺为 1 0 0g/m L。 3.4.2 红曲红素、 红曲素、 红曲红胺混合标准曲线工作液: 分别吸取混合标准储备溶液0.5 0 m L、 1.0 0m L、2.0 0m L、5.0 0m L、1 0.0 0m L于2 5
5、m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容至刻度, 混匀, 于4保存。 3.5 材料 N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯聚合物:2 0 0m g,6m L。使用前依次用5m L甲醇、5m L水活化。 4 仪器和设备 4.1 高效液相色谱仪, 配置紫外可见检测器。 4.2 分析天平: 感量为0.0 1m g和0.0 1g。 4.3 离心机: 转速40 0 0r/m i n。 4.4 高速均质器。 4.5 高速粉碎机。 4.6 固相萃取装置。 4.7 有机相型微孔滤膜: 孔径0.4 5m。 5 分析步骤 5.1 试样制备及保存 5.1.1 液体样品 将果汁及果汁饮料、 果味碳酸饮料等样品摇匀分装, 密闭常温或冷藏
6、保存。 5.1.2 半固态样品 对果冻、 风味发酵乳等样品取可食部分匀浆后, 搅拌均匀, 分装, 密闭冷藏或冷冻保存。 5.1.3 固体样品 饼干、 糕点、 熟肉制品等低含水量样品, 经高速粉碎机粉碎、 分装, 于室温下避光密闭保存; 对于固体 饮料等呈均匀状的粉状样品, 可直接分装, 于室温下避光密闭保存。 5.2 试样处理 5.2.1 液体样品 称取5g( 精确至0. 0 1g) 均匀试样( 若试样中含二氧化碳应先加热除去) 置于烧杯中, 用适量无水乙 醇溶解并转移至5 0m L容量瓶中, 加无水乙醇定容, 摇匀。准确移取上述提取液2 0m L于1 0 0m L鸡 心瓶中, 向鸡心瓶中加入
7、1 0m L无水乙醇, 在6 02下旋转浓缩至近干, 用2m L2 0%甲醇溶液洗 涤鸡心瓶2次。 将上述 待 提 取 液 全 部 转 移 至 经 过 预 活 化 的HL B固 相 萃 取 柱 中, 控 制 流 速 在1 m L/m i n 2m L/m i n, 弃去流出液。用5m L4 0%甲醇溶液淋洗净化柱, 弃去流出液, 再用5m L甲醇洗脱, 控制流 速在1m L/m i n 2m L/m i n, 收集洗脱液于2 5m L刻度离心管中, 洗脱液在4 5下氮吹干后, 用2m L 4 0%甲醇溶液振荡溶解残渣后过0.4 5m有机滤膜, 待测。 G B5 0 0 9.1 5 02 0 1
8、 6 3 5.2.2 半固体试样及固体试样 称取5g( 精确至0. 0 1g) 均匀试样, 放入5 0m L塑料离心管中, 向其中加入2 0m L8 0% 乙醇溶液, 1 50 0 0r/m i n均质提取2m i n,40 0 0r/m i n下离心3m i n, 上清液转移至5 0m L容量瓶中, 向残渣加入 2 0m L8 0%乙醇溶液重复提取1次, 合并提取液于同一容量瓶中, 用无水乙醇定容, 摇匀。 准确移取上述提取液2 0m L于1 0 0m L鸡心瓶中, 向鸡心瓶中加入1 0m L无水乙醇, 在6 0 2下旋转浓缩至近干, 用2m L2 0%甲醇溶液洗涤鸡心瓶2次。将上述待净化液
9、全部转移至经过预 活化的HL B固相萃取柱中, 控制流速在1m L/m i n2m L/m i n, 弃去流出液。用5m L4 0%甲醇溶液 淋洗净化柱, 弃去流出液, 再用5m L甲醇洗脱, 控制流速在1m L/m i n2 m L/m i n, 收集洗脱液于 2 5m L刻度离心管中, 洗脱液在4 5下氮吹干后, 用2m L2 0%甲醇溶液振荡溶解残渣后过0.4 5m有 机滤膜, 待测。 5.3 仪器参考条件 仪器参考条件列出如下: a) 色谱柱: 高纯度球形多孔硅胶多点键合C1 8色谱柱, 柱长2 5 0mm, 内径4.6mm, 粒径5m, 或 同等性能的色谱柱; b) 流动相:A: 乙
10、酸-乙酸铵溶液(p H=5) ,B: 甲醇, 梯度洗脱见表1; c) 柱温:4 0; d) 进样量:2 0L; e) 检测波长: 红曲红胺为2 6 4n m, 红曲红素和红曲素为3 9 0n m。 表1 流动相及梯度洗脱条件 时间 m i n 流速 m L/m i n 流动相A % 流动相B % 0.0 11.08 02 0 11.08 02 0 51.02 08 0 1 51.02 08 0 1 5.11.059 5 2 51.059 5 2 5.11.08 02 0 3 01.08 02 0 5.4 标准曲线的制作 将混合标准系列工作液及混合标准储备液分别注入高效液相色谱仪中, 测定相应的
11、峰高或峰面积。 以标准工作液的浓度为横坐标, 以峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线( 标准图谱见图A. 1) 。 5.5 试样溶液的测定 将试样溶液注入高效液相色谱仪中, 得到峰面积, 根据标准曲线得到待测液中红曲色素的浓度。如 果样品中红曲色素的含量超出标准曲线线性范围, 用2 0%甲醇溶液稀释待测样品溶液, 使待测液中红 G B5 0 0 9.1 5 02 0 1 6 4 曲色素浓度在线性范围内。 6 分析结果的表述 试样中红曲色素的含量按式( 1) 计算: X= V10 0 0 m10 0 010 0 0 (1) 式中: X 试样中红曲色素的含量, 单位为克每千克( g / k g ) ;
12、由标准曲线求得试样溶液中某红曲色素的浓度, 单位为微克每毫升( g /m L) ; V 样品溶液定容体积, 单位为(m L) ; 10 0 0 换算系数; m 最终样液代表的试样质量, 单位为克( g) 。 计算结果保留两位有效数字。 7 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 5%。 8 其他 方法检出限( L O D) : 当称样量为5.0g时, 红曲红素为3 0m g/ k g , 红曲素为0. 3m g / k g , 红曲红胺为 3m g / k g 。 方法定量限( L OQ) : 当称样量为5.0g时, 红曲红素为1 0 0m g/ k g , 红曲素为1m g/ k g , 红曲红胺为 1 0m g / k g 。 G B5 0 0 9.1 5 02 0 1 6 5 附 录 A 红曲色素的标准色谱图 红曲红胺、 红曲红素和红曲素的标准色谱图见图A.1。 图A. 1 红曲红胺、 红曲红素和红曲素的标准色谱图 ( 红曲红胺检测波长为2 6 4n m, 浓度为2 0m g/L; 红曲素和红曲红素检测波长为3 9 0n m, 浓度分别为1 0m g/L、 红曲红素10 0 0m g/L)
