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1、乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定L(-)-羟脯氨酸含量测定法1 主题内容与适用范围本方法规定了乳与乳制品制品中 L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法。本方法适用于乳与乳制品中 L(-)-羟脯氨酸含量的测定。本方法通过对 L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。2 引用标准GB9695.23-90 肉与肉制品 L(-) - 羟脯氨酸含量测定 3 原理试样经酸水解,释放出羟脯氨酸。经氯胺 T 氧化,生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺 T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长 558nm 处进行比色测定。4 试剂所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。
2、4.1 氯化亚锡(GB638):0.75溶液。将氯化亚锡 7.5g 溶于 500mL 水中,再加入 500ml 浓盐酸(GB 622)。 4.2 盐酸(GB622):6mol/L 溶液。4.3 氢氧化钠(GB629);1mol/L、10mol/L 溶液。4.4 缓冲液:将 50g 柠檬酸,26.3g 氢氧化钠和 146.1g 结晶乙酸钠(GB694) 溶于水,稀至 1L,此溶液与 200mL 水和 300mL 正丙醇混合。4.5 氯胺 T(HG3-972)溶液:将 1.41g 氯胺 T,溶于 10mL 水中 ,依次加入 10mL 正丙醇和 80mL缓冲溶液(用时现配)。4.6 显色剂:称取 1
3、0g 对二甲氨基苯甲醛,用 35mL 高氯酸(GB623) 溶解,缓慢加入 65mL 异丙醇。4.7 L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。4.7.1 标准储备液 500g/mL:称取 50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解,加一滴 6mol/L 盐酸,定容至 100mL 容量瓶中。4.7.2 标准工作液 5g/mL:吸取标准储备液 5.00mL 于 500mL 容量瓶中,定容。5.1 实验室常规设备。5.2 配有冷凝管的三角瓶:250mL。5.3 恒温水浴。5.4 试管加热器或水浴,可控温于 60。5.5 分光光度计。6 试样处理：6.1 方法 1：准确称取样品 2-5g（液体
4、样品 5-10g）放入 250mL 磨口三角瓶中。加几粒沸石。加入氯化亚锡溶液 100mL,置于水浴上加热回流 16h。趁热将水解溶液过滤于 200mL 容量瓶中,用 6moL/L 热盐酸 10mL 反复三次冲洗三角瓶和滤纸 ,冷却,用水定容到刻度,混匀。吸取 525mL(V1)水解液于 100mL 烧杯中,用 10mol/L、1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 为80.2,过滤于 250mL 容量瓶中,用 30mL 水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀,反复三次,把洗液并入滤液中,以水洗至刻度,摇匀备用。6.2 方法 2：准确称取一定量样品，精确到 0.0001g。使样品蛋白质含量在 102
5、0mg 范围内；将称好的样品放于水解管中。在水解管内加 6mol/L 盐酸 1015mL （视样品蛋白质含量而定）或加入 12mol/L 盐酸 1015mL，含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚（3.3）34 滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻 35min ，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近 0 psi） ，然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在 1101的恒温干燥箱内，水解 24h 后（如加入 12mol/L 盐酸，水解时间可缩短至 6h）后，取出冷却。 打开水解管，趁热将水解溶液过滤于 100mL 三角瓶
6、中,用 6moL/L 热盐酸 10mL 反复三次冲洗试管和滤纸,冷却,用水定容到刻度,混匀。吸取 525mL(V1)水解液于 100mL 三角瓶中,用 10mol/L、1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 为 80.2,过滤于 50mL 容量瓶中,用水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀,反复三次,把洗液并入滤液中,以水洗至刻度,摇匀备用。7 分析步骤7.1 测定7.1 标准曲线的绘制吸取 L(-)-羟脯氨酸标准工作液 0.00,10.00,20.00,30.00,40.00mL,分别置于 100mL 容量瓶中,定容摇匀。浓度分别为 0.0,0.5,1.0,1.5,2.0g/mL。取不同浓度的上述
7、溶液 4.00mL,分别加入20mL 具塞试管中,加氯胺 T 溶液 2mL,摇匀后于室温放置 20min。加入显色剂 2mL,摇匀,塞上塞子于 60试管加热器( 或恒温水浴)中保温 20min 后取出,迅速冷却,在波长 5582nm 处测定吸光值,绘制标准曲线。7.2 试样测定从待测液中吸取已制备好的样液 4.00mL 于 20mL 具塞试管中,以下按 7.1 步骤进行,同时作空白试验。8 分析结果的计算CV1A计算公式: X= 100m1000式中:X样品中 L(-)-羟脯氨酸的含量,;C从标准曲线上查得相应的 L(-)-羟脯氨酸量,g;m称取试样的质量,g;V1样液体积,mL。A稀释倍数当符合允许差所规定的要求时,取两次测定结果的算术平均值作为结果,结果精确到 0.01。9 允许差同一分析者同时或相继进行的两次测定结果之差不得超过平均值的 5。10 判定方法因 L(-)-羟脯氨酸为胶原蛋白中的特有组分，其含量占 10%以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有 L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白
