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1、核酸的酚抽提实验报告实验原理在 EDTA 和 SDS 等去污剂存在下，用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组 DNA，用此方法得到的 DNA 长度为 100150kb,适用于 噬菌体构建基因组文库和 Southern 印迹分析。实验试剂1. 5mol/L NaCl；0.5mol/L Tris-Cl，pH8.0；0.5mol/L EDTA，pH8.0；3mol/L NaAc，pH 5.2；分别进行高压灭菌。2. 蛋白酶 K：10mg/mL，配好后用一次性过滤器过滤，-20保存。3. 组织匀浆液：100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-Cl(pH8.0),2
2、5mmol/L EDTA(pH8.0)。4. 酶解液：200mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-Cl(pH8.0),50mmol/L EDTA(pH8.0),200g/mL 蛋白酶K，1%SDS。5. 无 DNA 酶的 RNA 酶：将胰 RNA 酶溶于 10mmol/L Tris-Cl(pH7.5)、15mmol/L NaCl 溶液中，浓度10mg/mL，于 100水浴处理 15min 以破坏 DNA 酶，缓慢冷却到室温，-20保存。6. TE 缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。7. 平衡酚(pH8.0)氯仿异戊醇2
3、5241(体积比)。8. 氯仿异戊醇=241(体积比)。实验步骤1. 取 0.2g 鼠肝，用冰冷的生理盐水洗 3 次后置于 2.0mL 匀浆液中，在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在，但勿将细胞破碎。2. 将冰冷的匀浆液移至 1.5mL 离心管中，5000r/m 离心 3060s，弃上清。沉淀加 0.8mL 无菌水迅速吹散，分两管，再加 0.4mL 酶解液，缓慢翻转混匀，55水浴处理 1218h。3. 沉淀加 RNase 至终浓度 200g/mL,37水浴 1h。4. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇缓慢旋转混匀，冰浴冷却，10000r/m 离心 10min。含 DNA 的水相一般在上层，中间
4、为蛋白质沉淀，下层为有机相，但 DNA 浓度过高时，含 DNA 的水相会在下层，要注意观察判断。5. 用扩口吸管移出含 DNA 的水相，加等体积氯仿/异戊醇，冰浴预冷，10000r/m 离心 10min，若界面或水相中蛋白含量多，可重复 4，5 操作。6. 用扩口吸管小心吸出上层含 DNA 的水相，加 1/10 体积的 NaAc，小心充分混匀，再向每管中加入 2.5 倍体积的无水乙醇，-20过液。7. 12000r/m 离心 15min，弃上清，75%冷乙醇洗涤一次，12000r/m 离心 15min，室温干燥(不要太干，否则DNA 不易溶解)，加入适量 TE 缓冲液，存放于 4，轻摇溶解过夜，即可得实验用动物基因组 DNA。注意事项1、记住离心管编号。 2、在离心管平衡后，对称放入离心机，切忌将没加管套的离心管放入离心机，离心完后取出离心管。3、避免液体洒在离心机上面或钻头上。4、启动离心机后，离心机如有不正常反应或噪音，应立即停止离心，并分析原因。5、各操作步骤要轻柔,尽量减少 DNA 的人为降解6、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告报告题目 核酸的酚抽提实验报告姓 名 学 号 专 业 批次/层次 指导教师 学习中心
