pcr数据分析

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1、一般来讲，进行 real-time qPCR MasterMix 都是 2的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于 real-time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做 3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于 Ct 相差较多或者 SD 太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为 100-400mM；模板如果是总 RNA 一般是 10ng-500，如果 cDNA，通常情况下是 1ul 或者 1ul 的 10 倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用 MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在

2、反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在 4 度。 2. 更多的配制 Mix 进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。一般来讲，进行 real-time qPCR MasterMix 都是 2的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于 real-time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做 3 个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于 Ct 相差较多或者 SD 太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为 100-400mM；模板如果是总 RNA 一般是10ng-500，如果 cDNA，通常情况下是 1ul 或者

3、 1ul 的 10 倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用 MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在 4度。3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样 ！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。5. 每个样品至少 3 个平行孔。参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是 ABI 的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测 PCR 产物的荧

4、光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非 PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把 ROXTM 配制在 MasterMix 或者 Premixture 里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加 ROXTM 染料校正。通常来讲，real-time qPCR 的反应程序不需要像常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸 3 步。由于其产物长度在 80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBRGreen 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断 PCR 产物的特异性扩增。而溶解

5、程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。 3. 仪 器设置所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以ABI StepOne 为例，详细看一下反应设置：A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。B. 实验方法的 选择：我们选 用的比较 Ct 的 SYBR Green 方法，Fast 程序，以 cDNA 为模板进行。C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D. 样 品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负

6、对照的设置和生物重复的设置。E. 对照 组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F. 反 应 程序的设置：PCR 反应 程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如 BioTeke 的 95 2 分钟就可以激活 DNA 聚合酶（ABI 的需要 10 分钟）。循环反应是 9515 秒，6015 秒的40 个循环。溶解曲 线程序采用 仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G. 反应 体系的设置：A-G 这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。 需要注意一点 ABI 仪器需要加 ROX 参比染料，默认的是ROX。有些公司是把 ROX 或者其他染料配制在 M

7、asteMix 里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的 MasterMix 进行这一个步骤的选择。BioTeke 的 MasterMix 里没有参比染料，所以选择“none”。设置好之后，就可以把配置好的 PCR 管放进仪器，点击RUN！五、Real-time qPCR 数据分析1. Real-time qPCR 常见参数基线（baseline ）通常是 3-15 个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold）自动设 置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对

8、不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。 Ct 值:与起始 浓度的对数成线 性关系。 分析定量时候一般取 Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。Rn： Rn 是 Rn 扣除基线后得到的标准化结果（Rn=Rn-基线）。 2.影响 Ct 值的关 键因素模板浓度模板浓度是决定 Ct 的最主要因素。控制在一个合适范围内，使 Ct 在 15-35 之间。反应液成分的影响任何分子的 荧光发射都受 环境因素影响- 比如溶液的 pH 值和盐浓度。 PCR 反应的效率

9、PCR 反应的效率也会影响 Ct 值。在 PCR 扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与 PCR 扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR 效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在 90-110%之间都是可以接受的。 3. 如何评估实时定量 PCR 反应的效果PCR 扩增效率： 为了正确地评估 PCR 扩增效率，至少需要做 3次平行重复，至少做 5 个数量级倍数(5logs) 连续梯度稀释 模板浓度。常见问题1. 无 Ct 值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般 SG 法采用 72延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引

10、物或探针降解: 可通过 PAGE 电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct 值 出现过 晚（Ct38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR 各种反应 成分的降解或加样量的不足。PCR 产物太长 : 一般采用 80-150bp 的产物长度。 3. 标 准曲线线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模

11、板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入，或

12、通过引物设计避免非特异扩增。6. 扩 增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有 PCR 反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性 如果扩增效率在 90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩 增曲线的异常？比如“S” 型曲线？ 参比染料设定不正确(MasterMix 不加参比染料时，选 NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解 荧光定量 PCR 问题汇总1. 定

13、量 PCR 仪的开关机顺序是怎 样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量 PCR 仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量 PCR 的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量 PCR 仪主机的电源，最后关闭电脑。2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量 PCR 实验使用？有何需要注意的地方？ 定量 PCR 实验可以使用以下耗材：96 孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml 光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml 光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI 公司生产的定

14、量 PCR 耗材的具体使用方法和货号见下表：3. 为 什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？当运行实时定量 PCR 仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。碎片整理的方法如下： 在 Windows 桌面上，选择 开始(start) ，我的电脑(My computer)。 在(我的电脑)窗口中，用鼠 标右

15、键单击硬盘驱动器，并 选择(属性)property 。 在(属性)对话框中选择 工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。 单击碎片整理(Defragment)。 当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。 在“本地磁盘属性”对话 框中，单击（确定）。 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。4. 何 时执行 windows service pack 更新？不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量 PCR 仪的计算机的操作系统。新版本的 Microsoft Windows 操作系统有可能与 SDS 软件存在冲突，并导

16、致仪器不能正常运行。如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随 SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题。5. 应该备份哪些数据？应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量 PCR 仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下图是校正文件的样本。6.怎么样的实验 室环境才能保 证仪器设备正常运行？良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：电源：推荐配备合适的 UPS 或稳压器。通风：仪器的通风应该没有阻挡。温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在 10-30C 之间。湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。空间：易于操作，安全。7. 怎样判断定量 pcr 仪