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1、专题五 血红蛋白的提取和分离【知识框架】1. 分离不同种类蛋白质可以利用蛋白质各种特性的差异，如分子的_、所带电荷的_、_、_和对其他分子的_等。凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法；电泳是指带电粒子在_的作用下发生_的过程，许多重要的生物大分子，如、等都具有，在下，这些基团会带上，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异以及 _ 、 的不同，使带电粒子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。常用的电泳法有_电泳和_电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于以及等因素。在测蛋白质分子量（纯度鉴定）时通常使用_ 电泳。
2、2.当相对分子质量不同的蛋白质通过琼脂凝胶层析时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部，路程较 ，移动速度 ；而相对分子质量大的蛋白质无法进入凝胶内部，路程较 ，移动速度 ，导致相对分子质量小的 流出，相对分子质量大的 流出，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3.蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、粗分离、 和 。（1）样品（哺乳动物的血液）处理和粗分离样品处理和粗分离的过程为： 。红细胞的洗涤：目的：去除；方法：离心。采集血样前，盛血容器中需预先加入_作为_，以防止_。采血后应及时分离_和_，分离方法采用_（500r/min离心10min），分离后，去除_层透明的黄色血浆，将_层_色红
3、细胞倒入烧杯，加入_倍体积的_，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次以上，直至_，表明红细胞已洗涤干净。洗涤红细胞时，洗涤次数过少，无法将_全部除去，如果血液样品离心后分层不明显，可能原因是；离心速度过_和时间过_，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到的红细胞，影响后续提取的血红蛋白的。血红蛋白的释放：将已洗涤干净的红细胞倒入烧杯，加到原血液的体积，使红细胞_，再加40%体积的，使_溶解，置于_搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 红细胞破裂释放出血红蛋白。分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度进行高速离心10 min ，离心管中的溶
4、液从上往下分为4层:第1层（最上层）：的_层第2层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体第3层（中下层）：的水溶液层，的液体第4层（最下层）：其它杂质的沉淀层将试管中的液体用过滤、除去，于中静置片刻后，分离出下层的。粗分离：即。将装有血红蛋白溶液的透析袋放入pH为7.0的_中，透析12h，透析的原理是 _ _ ， 透析的目的是_ _。（2）血红蛋白的纯化凝胶色谱法(层析)制作色谱柱：柱体是长40cm、内径1.6cm的玻璃管，柱顶部插入安装了_的橡皮塞，柱底部插入安装了_（带头部）的橡皮塞（橡皮塞上部切成锅底状凹穴），在橡皮塞中安装移液管时，移液管上部_（必需/不能）超过橡皮塞凹穴底面，凹穴上覆盖尼龙
5、网，再用尼龙纱将橡皮塞上部包好插入柱体的下端，移液管头部作为出口部位，连接细尼龙管，用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭。装填凝胶色谱柱：商品凝胶使用前直接放在中膨胀，并用将加入洗脱液的_加热至接近沸腾，这种方法既加速凝胶膨胀，又除去凝胶中可能带有的_和排除凝胶颗粒内的_。因为干的凝胶和用缓冲液（洗脱液）平衡好的凝胶的体积差别_（不大/很大），所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算。交联葡聚糖凝胶（SephadexG-75）的“G”表示凝胶的_、_及_，“75”表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水_g。凝胶装填色谱柱时，色谱柱下端连接的尼龙管应_（打开/关闭），将配制好的凝胶悬浮液_（一次性/分多次
6、）缓慢倒入色谱柱内，期间_（可以/不能）轻微抖动色谱柱，使凝胶装填均匀，凝胶色谱柱内不得有存在，否则会搅乱洗脱液中蛋白质的，降低。一旦发现凝胶柱内有气泡，必需_。凝胶装填完毕，立即连接盛有_（pH为7.0）的洗脱瓶，在50cm高的操作压下充分洗涤平衡，使凝胶装填紧密。样品的加入和洗脱：加样前，打开色谱柱下端的流出口，让色谱柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降，当缓冲液缓慢下降到_时关闭出口，然后按照下图顺序加样，最后连接装有缓冲液的洗脱瓶进行洗脱，待红色蛋白液接近色谱柱底部时，用试管收集流出液，每试管_mL。如果凝胶色谱柱装填成功、分离操作正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带_、_、_地随着洗脱液缓慢
7、流出，反之，如果凝胶色谱柱的装填不好，红色区带_、_、_，分离效果不好。通过凝胶色谱(层析)除去透析后的血红蛋白溶液中的。（3）纯度鉴定：判断的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是。十二烷基硫酸钠（SDS）能与各种蛋白质形成“蛋白质SDS复合体”， SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子的电荷量，掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，电泳时，蛋白质的迁移速率完全取决于_，蛋白质由点样孔向_极迁移，点样孔在_极一端；SDS能使蛋白质发生完全变性，多肽链蛋白质解聚成单条肽链，因此，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的结果是_的分子量。将纯化的血红蛋白样品与若干已知分子量的
8、标准蛋白分别加入到电泳装置上槽的点样孔中，电泳后，观察血红蛋白条带与标注蛋白条带的位置，可确定提取的蛋白质的分子量。图甲的上、下槽中加入_，上、下槽之间是_。比较图乙条带蛋白质的分子量大小：_。4血红蛋白的提取和分离常见试剂及其作用：柠檬酸钠： ； 生理盐水： ；蒸馏水：使红细胞_；40%的甲苯溶液： ；磷酸缓冲溶液：维持pH稳定，使血红蛋白的_不受破坏。5缓冲溶液能够在一定的范围内，能抵制外来_对溶液_的影响，维持基本不变，缓冲溶液通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得使用的缓冲液。【核心要点】1.凝胶色谱层析法 蛋白质项目相对分子质量大相对分子质量小凝胶内部不能进入能进入
9、运动方式垂直向下垂直向下和无规则扩散运动经过路程较短较长洗脱次序先流出后流出2.电泳法原理在一定pH下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3比较琼脂糖凝胶电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。4实验操作程序
