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1、1,第六章 分子生物学 基本操作技术,2,第一节 核酸的提取 第二节 核酸杂交技术 第三节 PCR技术,3,第一节 核酸的提取,一、提取核酸的基本步骤,（一）总则 保证核酸一级结构的完整性； 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度； 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 应尽量去除非目标核酸分子。,4,（二）措施 温度不要过高； 控制pH值范围(pH值5-9)； 保持一定离子强度； 减少物理因素对核酸的机械剪切力； 所用器械和一些试剂需高温灭菌； 提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级
2、结构。,5,（三）核酸分子抽提的技术设计,1、核酸的释放-破裂细胞，释放核酸。 高速组织捣碎机捣碎 玻璃匀浆器匀浆 超声波处理法 液氮研磨法 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）,6,2、核酸的分离与纯化 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非目的核酸分子、试剂 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤,7,4、核酸的鉴定 浓度鉴定 浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液-紫外
3、分光光度法。 DNARNA浓度(g/ml)=OD260稀释倍数5040 低浓度核酸溶液-溴化乙锭荧光光度法。 纯度鉴定 DNA:OD260/OD280=1.8；OD260/OD2302.0。 RNA:OD260/OD280=1.7-2.0；OD260/OD2302.0。 完整性鉴定-凝胶电泳法,8,5、核酸的储存 DNA： 溶于pH8.0的TE（tris和EDTA）缓冲液中，4 或-20 保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 RNA： 溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存; 溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 保存。或加1滴0.2 mo
4、l/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70。,9,二、基因组DNA的分离与纯化,（一）样品准备,常见的标本：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞、细菌等。 生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存70或液氮中。,10,（二）DNA提取,1、酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100150kb。,11,主要试剂及其作用： EDTA： 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 降低细胞膜的稳定性。 SDS： 溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜破裂； 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出
5、来； 对RNA、DNA酶有抑制作用； 与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。,12,蛋白酶K： 消化DNA酶和细胞中的蛋白质。可与SDS、EDTA同时使用，仍保持较高活性。 酚： 使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酶活性。 pH8.0的Tris溶液： 使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。 酚或酚-氯仿中少许的异戊醇： 减少气泡的产生，利于分相，保持分相的稳定性。,13,2 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤。 适用于从标本中制备高分子量的DNA样品-可得
6、200kb左右的DNA。,14,3 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。,15,4 异丙醇沉淀法： 基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）。,16,5 表面活性剂快速制备法： 用Triton X-100或NP-40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。,17,（三）DNA样品的纯化 方法：透析、层析、电泳及选择性沉淀。 琼脂糖电泳适用于0.1-60Kb片段，聚丙烯酰胺（PAGE）电泳适用于5-500bp大小的片段。,18,（四）DN
7、A的浓缩,1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。 2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。,19,（六）DNA回收,主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率，去除回收DNA样品中的污染物。 电泳到DEAE-纤维素膜：500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。 透析袋电洗脱： 低熔点琼脂糖凝胶：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。,20,核酸分子杂交 （nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单
8、链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子杂交分子。,第二节 核酸杂交技术,一、核酸分子杂交的基本原理,21,1、DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子的过程。 常用的变性方法： 热变性；酸碱变性；化学试剂变性,22,2、DNA的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(ann
9、ealing)。,23,3、解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)：,使50%的DNA发生变性时的环境温度。,24,增色效应： DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。,减色效应： 变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。,25,单链核酸的起始浓度：浓度越高，复性越快。 核酸链长度：越长，形成配对的难度越大，复性也慢。 核酸分子的复杂性：复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。,影响复性的因素,26,温度：温度过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比Tm低25。 离子强度：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团
10、所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。但离子强度过高也不利于复性。,Tm值与核酸含量的关系 20bp Tm = 69.3+0.41(GC)%,27,4、杂交,来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。 杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。 核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列。,28,29,探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越
11、高，配对难度也增大。 离子强度：高离子强度溶液中，有利于杂交分子形成。,影响核酸分子杂交的因素,30,温度：通常在低于Tm 20-25的温度下进行杂交。 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。 杂交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸杂交的Tm。含30%50%甲酰胺的杂交温度能降低到3042。较低的杂交温度，使探针更稳定，并能更好地保留非共价结合的核酸。,31,4、预杂交,为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂交前的这些处理过程称为预杂交。,32,常用于预杂交的封闭物,变性的非特异性DNA：
12、常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhardt溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。,33,二、核酸探针,指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。 核酸探针的类型： 寡核苷酸探针、基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、单链DNA探针。 常用的探针标记物： 放射性同位素（3H、32P、
13、35S、125I）；非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）。,34,三、核酸分子杂交信号的检测,放射性同位素标记探针： 放射自显影。 非放射性同位素标记探针： 偶联反应+显色反应。,35,四、核酸分子杂交技术,固相杂交：结合于某种固相支持物上的待测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。 液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中进行杂交反应。,36,（一）膜上印迹杂交,将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程称为膜上印迹杂交。 印记的方法： 虹吸印迹法；真空转移法；电转移法,37,DNA或RNA 电泳分离核酸片段
14、 转移至固相支持物（印迹技术） 杂交 洗去未杂交探针 杂交信号检测,38,Northern 杂交 原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。 应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。 方法：提取组织细胞总RNARNA定量变性胶电泳转膜干膜预杂交杂交洗膜压片洗片图像分析,39,Western印迹杂交,将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。,斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,适于核酸样品定量检测。,40,（二）原位杂交
15、,用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。 原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。,41,取材 组织、细胞固定 预杂交 杂交 放射自显影或免疫酶法显色 观察结果,42,（三）液相杂交,RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法,43,待测RNA样品 液相杂交 DNA-RNA杂交双链 酶解 杂交体系纯化 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影,单链DNA探针（M13体系合成）,44,待测RNA样品 液相杂交 RNA-RNA杂交双链 酶解 杂交体系纯化 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影, 单链RNA探针,45,聚合酶链式反应：
16、在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。,第三节 PCR技术,46,PCR反应的特点,特异性强：引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性。 灵敏度高：指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速：2-4 小时完成扩增。 对标本的纯度要求低：DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。,47,一、PCR反应原理和反应过程,DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 C 95 C 退火（annealing）:40 C 70 C 延伸（extension）:72 C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。,48,二、PCR的反应体系和反应条件,（一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 缓冲液等。,49,1、模板（template）,包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。 模板DNA需较高的浓度 RNA作为模板时，须先将RNA
