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1、生物化学与分子生物学 常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的 原理及应用原理及应用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology 第二十章第二十章 第一节 分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization and Blotting Technique 核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA复性过程中复性过程中，如果把不同如果把不同DNA单链单链 分子放在同一溶液中分子放在同一溶液中，或把或把DNA与与RNA放在一
2、放在一 起起，只要在只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定 的碱基配对关系的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形就可以在不同的分子之间形 成杂化双链成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNADNA （一）印迹技术（一）印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子 转移到转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因 此称之为“此称之为“blot
3、ting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其 末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为 “探针探针”，探针可以与固定在”，探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷 酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术（二）探针技术 二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用 （一）（一）DNA印迹印迹 (Southern blotting) （二）（二）RNA印迹印迹 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹（三）蛋白质
4、的印迹 (Western blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 其他：其他： 斑点印迹斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip) 三 种 印 迹 技 术 的 比 较 三 种 印 迹 技 术 的 比 较 分子杂交实验分子杂交实验 放放 射射 自自 显显 影影 照照 片片 D
5、NA芯片芯片 技术技术 第二节 PCR技术的原理与应用 The Principle and Application of PCR Technology 5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Template DNA 一、一、PCR技术的工作原理技术的工作原理 5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量 可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。 PCR技术原理示意图技术原理示意图 PCR的基本反应步骤的基本反
6、应步骤 变性变性 9595 C C 延伸延伸 72C 退火退火 Tm-5C 模板模板DNA 特异性引物特异性引物 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR体系基本组成成分体系基本组成成分 利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获为模板获 得已知目的基因片段得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合或与逆转录反应相结合，直直 接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段； 利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得文库或基因组文库中获得 序列相似的基因片段；序列相似的基因片段； 利用随机引物从利用随机
7、引物从cDNA文库或基因组文库中克隆文库或基因组文库中克隆 基因基因。 二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途 （一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆 利用利用PCR技术可以随意设计引物在体技术可以随意设计引物在体 外对目的基因片段进行嵌和外对目的基因片段进行嵌和、缺失缺失、点突点突 变等改造变等改造。 PCR技术高度敏感技术高度敏感，对模板对模板DNA的的 量要求很低量要求很低，是是DNA和和RNA微量分析的微量分析的 最好方法最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析 （二）基因突变（二）基因突变 将将PCR技术引入技术引入DNA序列测定序列测定，使测序使测序 工作
8、大为简化工作大为简化，也提高了测序的速度；也提高了测序的速度； 待测待测DNA片段既可克隆到特定的载体后片段既可克隆到特定的载体后 进行序列测定进行序列测定，也可直接测定也可直接测定。 PCR与其他技术的结合可以大大提高基与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性 。 （四）（四）DNA序列测定序列测定 （五）基因突变分析（五）基因突变分析 逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT- PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合 应用的一种技术。应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基
9、因是目前从组织或细胞中获得目的基因 以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分 析的最有效方法。析的最有效方法。 （一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术 三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术 原位原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片是在组织切片或细胞涂片 上的单个细胞内进行的上的单个细胞内进行的PCR反应反应，然后用特异然后用特异 性探针进行原位杂交性探针进行原位杂交，即可检出待测即可检出待测DNA或或 RNA是否在该组织或细胞中存在是否在该组织或细胞中存在。 原位原位PCR方法弥补了方法弥补了PCR技术和原位杂交技术技术和原
10、位杂交技术 的不足的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的是将目的基因的扩增与定位相结合的 一种最佳方法一种最佳方法。 （二）原位（二）原位PCR技术技术 （三）实时（三）实时PCR技术技术 实时实时PCR(real-time PCR)技术通过动态技术通过动态 监测反应过程中的产物量监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积消除了产物堆积 对定量分析的干扰对定量分析的干扰，亦被称为定量亦被称为定量PCR。 实时实时PCR技术原理技术原理 Q R 3 3 5 5 上游上游 引物引物 下游下游 引物引物 荧光标记引物荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 实时实时PCRPCR分类：分类： 实时实时PRC
11、 非探针类非探针类 探针类探针类 1. TaqMan1. TaqMan探针法探针法 2. 2. 分子信标探针法分子信标探针法 3. FRET3. FRET探针法探针法 图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图 第三节 基因文库 Gene Library 基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library) cDNA文库文库(cDNA library) 基因文库基因文库( (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列 的克隆群体。的克隆群体。 一、基因组一、基因组DNA文库文库 基因组基因组DNADNA文库
12、是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的 信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA 片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、噬菌体、 粘粒和酵母人工染色体等。粘粒和酵母人工染色体等。 基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选 第一轮筛选第一轮筛选 第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条 件下所表达的全部件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转
13、录而合成的经逆转录而合成的 cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形 式贮存着该组织细胞的基因表达信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、二、cDNA文库文库 第四节 生物芯片技术 Biological Chip Technique 是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排片段有规律地紧密排 列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧 光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等 对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的对芯片进行扫描，通过计算机系统对
14、每一位点的 荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出 定性和定量的结果。该技术亦被称作定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列 (DNA microarray)。 一、基因芯片一、基因芯片 基因芯片基因芯片(gene chip) 基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反当与待测蛋白样品反 应时应时，可捕获样品中的靶蛋白可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统再经检测系统 对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术对
15、靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片 蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应 蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip) 蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理 第五节 生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选噬菌
16、体显示系统筛选 常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱 原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 （一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋 白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结 合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结 合的未知分子。合的未知分子。 标签融合标签融合 蛋白沉淀蛋白沉淀 实验流程实验流程 示意图示意图 （二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途 酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系
