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1、RNAhybrid进行植物miRNA靶位点预测，需要满足以下条件：1、 miRNA的第8到12个碱基与mRNA必须是完全配对的。2、 是指上下两条链都错配而形成错配环，这种错配环中任何一条链的错配碱基不能超过1个。3、 突出环即一条链多了一个碱基的突出，这种突出环最多突出一个碱基。4、 允许G:U配对5、 末端未配对的突出不能超过两个碱基。6、 不允许存在连续3个碱基的错配。7、 总数不超过4个碱基的错配。8、 Mfe cut-offs 75%，Mfe cut-offs were defined as the percentage of the mfe of the actual miRNA:
2、mRNA hybrid compared to the mfe of a perfect match, calculated with RNAhybrid and with the same miRNA.即miRNA:mRNA杂交的实际的最小自由能要满足同样的miRNA和mRNA完全匹配时的75%。需要注意的一点是在最新的拟南芥的miRNA靶位点预测结果中发现，miRNA的靶位点存在很多类并没有主要集中在转录因子上。命令为RNAhybrid -g ps -b 1 -e -25 f 8,12 -u 1 -v 1 -s 3utr_worm -t target -q mi其中-g把杂交的结果以图片的
3、格式输出，其中存在三种格式ps, png or jpg format，任何一种都是可以的，我查了一下ps用的比较多，所以可以选择这种，则命令就是-g ps，也可以选择-g all，则三种格式均输出但是没有必要。-b 1意思是一个小RNA和一个靶基因的某一段序列匹配情况最多列出几次，比如一个小RNA和一个靶基因的某一段序列匹配存在多种情况，则-b为1的话则只列出最优的匹配情况，一般选1就比较好。-e两条序列匹配的最低自由能。先可按照-30看效果。f 8,12即要求miRNA的第8到12个碱基必须是完全配对的。-u 2是指上下两条链都错配而形成错配环，如上图16和17位这种错配环中任何一条链的错配
4、碱基不能超过两个。-v 1是指如3号位置形成的突出环即一条链多了一个碱基的突出，这种突出环最多突出一个碱基。-s 3utr_worm是做了一个参比。是必须的，具体原理不太清楚。-t target -t代表靶基因，target是靶基因的文件名。-q mi-q是miRNA，mi是miRNA序列文件名。除了以上的参数，最好还能符合以下两条。1) 一般不超过4个碱基的错配3) 一般没有连续的错配 (=3个)出现。以下是文献中用这个软件做出的比较好的结果。TAIR9_3_UTR 3 UTR序列，即指每个基因的3端非编码序列。TAIR9_5_UTR 5 UTR是指每个基因的5端非编码序列。TAIR9_cdsCDS序列包含了线粒体和叶绿体的编码区序列。仅包括启动子到终止子之间的序列，没有内含子序列和UTR（非编码）区序列。TAIR9_intergenic_ 包含了拟南芥所有已注释的基因之间的序列。TAIR9-intron 包含了所有拟南芥基因组注释基因的内含子序列。其中，对于目前发现的植物的mIRNA靶位点而言，主要是基因的cds区，部分存在于与3 UTR区的。但是其他的区域也是有可能的。intergenic基因间区很有可能是编码miRNA的前体基因的位置。所以以上几项都要进行分析，一个基因可以认为是UTR+内含子+cds，之所以分开是为了判断究竟靶定上的属于一个基因的哪一个位置。序列比较多，
