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1、不同有机氮源对葡萄酒发酵的作用不同有机氮源对葡萄酒发酵的作用 2018/05/15 葡萄酒2018年第4期摘要：分别使用酵母浸粉和混合氨基酸作为模拟葡萄汁（36Bx）的有机氮源发酵葡萄酒，以保证葡萄酒的正常发酵和最终产品品质。通过测定发酵过程中的二氧化碳生成量、还原糖、可同化氮、甘油和挥发性化合物含量变化，比较酵母浸粉和混合氨基酸对葡萄酒品质的影响。结果表明，使用酵母浸粉耗还原糖量为295.7g/L，生成乙醇97.20g/L、甘油26.50g/L、乙酸1.08g/L和乙酸乙酯46.05mg/L，与使用混合氨基酸相比，多消耗还原糖130.47g/L，多生成乙醇46.14g/L、甘油7.95g/L
2、和乙酸0.54g/L，增幅分别为78.95%、90.38%、42.84%和99.35%。使用酵母浸粉比混合氨基酸的发酵程度大，速度快。因此，可用适量酵母浸粉替代混合氨基酸作为葡萄酒发酵的氮源补充。关键词：葡萄酒；氮源；发酵；酵母浸粉；氨基酸随着葡萄酒消费量的增加，对葡萄酒品质的要求也越来越高。葡萄酒品质与酿酒葡萄原料和酿造工艺密切相关1。酵母可同化氮（yeastassimilablenitrogen，YAN）即能被酵母利用的氮源，主要是除脯氨酸外的-氨基酸、小分子多肽和铵态氮这三类氮源2。葡萄原料的可同化氮含量直接影响酵母菌的生长和代谢，从而影响葡萄酒的发酵过程和最终产品质量。当酿酒葡萄中可同
3、化氮含量过低时，会影响发酵速度并产生有刺激性的二氧化硫气体影响酒的品质3。为保证氮源不足的葡萄原料正常发酵，常添加无机氮源如磷酸氢二铵，或添加氨基酸。添加铵盐或单一氨基酸会导致酵母利用更多的糖合成氨基酸，使乙醇转化率下降，同时影响葡萄酒中有机酸生成4。使用混合氨基酸作为补加氮源能保证葡萄酒发酵的进程和品质5。酵母浸粉含有大量的氨基酸、肽、小分子蛋白、核苷酸、糖、维生素和风味化合物，常用作抗生素、氨基酸、有机酸、酶制剂等发酵生产的氮源6，也有用作酸奶发酵氮源的探讨7。在葡萄酒氮源补充方面，目前主要选用无机氮源和氨基酸，对混合氨基酸作氮源的研究仅测定了糖、甘油、乙醇、乙酸等呈味物质，并未测定高级醇
4、产量8-10。而且，尚无酵母浸粉的应用先例。为了探究酵母浸粉是否适合作为葡萄酒发酵的补加氮源，本研究分别以相同可同化氮含量的酵母浸粉和混合氨基酸作为模拟葡萄汁唯一氮源，进行葡萄酒发酵，从发酵过程中的二氧化碳生成量以及还原糖、可同化氮、甘油和挥发性化合物含量，对比两种氮源对葡萄酒发酵过程和葡萄酒品质的影响，以探究酵母浸粉作为葡萄酒发酵氮源不足时补加氮源的可能性。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1实验材料商业酵母ST：法国LAFFORT公司；717型阴离子交换树脂：天津市科密欧化学试剂有限公司。1.1.2化学试剂葡萄糖、果糖：山东西王药业有限公司；酵母浸粉（生化试剂）：北京奥博星生物试剂有限公
5、司；各种氨基酸、乙醛：上海阿拉丁生化科技有限公司。乙醇：国药集团化学试剂有限公司；乙酸：天津市恒兴化学试剂有限公司；乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇：天津市科密欧化学试剂有限公司；异戊醇：天津市光复科技发展有限公司。所有试剂均为分析纯。1.2仪器与设备GC6850气相色谱仪：安捷伦科技有限公司；722S可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TELTA320pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；CR21G离心机：日立工机株式会社。1.3方法1.3.1酵母驯化为了适应葡萄酒发酵的高糖低温环境，需对活性干酵母进行逐级驯化，再将种子液接种到发酵液中。本实验涉及的活性干酵母驯化步骤如下：称取1g活性干酵母加入
6、10mL无菌水中进行溶解，在38条件下恒温培养15min，每5min轻微搅动一次。随后加入10mL稀释2倍的模拟葡萄汁，在25条件下恒温培养1h，每30min搅动一次。最后加入20mL模拟葡萄汁，20条件下恒温培养2h，每30min搅动一次。得到酵母种子液。1.3.2模拟汁成分葡萄糖180g/L、果糖180g/L、柠檬酸0.5g/L、苹果酸5g/L、酒石酸5g/L、磷酸二氢钾5g/L、无水硫酸镁0.5g/L。氮源：两组分别添加酵母浸粉和混合氨基酸作为唯一氮源，氮源添加量为180mg/L酵母可同化氮（YAN）。此含量为普通葡萄汁中平均有机氮源含量。即分别添加酵母浸粉3.9g/L，混合氨基酸（18
7、0mg/L）11。1.3.3葡萄酒发酵每瓶接入驯化后的种子液12mL，于18条件下控温发酵。发酵体系为1L玻璃瓶：瓶高35cm，直径7.6cm，瓶口外径2.5cm，瓶径长6cm。在1L酒瓶中装500mL模拟汁，每瓶接入驯化后的种子液12mL，于18条件下控温发酵。发酵前2d用棉塞封瓶口，当发酵液中有气体产生时，把棉塞换为发酵栓，进行厌氧发酵。1.3.4取样及样品预处理发酵过程中前期（010d）每3天取样一次，中期（1020d）和后期（2030d）每5d取样一次，取样量为35mL。发酵液于4，10000r/min离心10min得发酵上清液，将其保存于-20冰箱中，待测定。测定各理化指标时，于4冰
8、箱中解冻。1.3.5分析检测二氧化碳生成量测定：采用发酵体系失重测量法。充分晃动装有发酵栓的玻璃瓶，使发酵液充分混匀且其中溶解的二氧化碳完全溢出，然后采用电子天平进行测量12。还原糖含量测定：将发酵上清液用去离子水稀释至适当浓度，用3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylicacid，DNS）法测定还原糖含量13。甘油含量测定：采用高碘酸氧化法14。步骤：处理树脂。用1mol/LNaOH和HCl按照碱-酸-碱的顺序对2017型强碱阴离子交换树脂进行洗脱。洗脱时用树脂体积的35倍的1mol/LNaOH或HCl洗脱1h，最后用去离子水洗至中性并用17g/L的AgNO3检测是否有氯离子存在
9、，如有则继续用去离子水洗至无氯离子后备用。装柱。取洗脱后的树脂，填装到长20mL，内径1cm的玻璃柱中，调整液面高于树脂表面0.5cm左右。上样。取2mL发酵上清液加入到玻璃柱中。收集洗脱液。上样后开始收集洗脱液，控制流速为2mL/min左右。洗脱时，加入无二氧化碳去离子水保持液面距树脂表面0.5cm左右，每管收集洗脱液2mL。洗脱液检测。每管洗脱液中取0.2mL进行还原糖检测，直至洗脱液中出现还原糖为止。可同化氮含量测定：采用甲醛值法15。量取50mL甲醛溶液于100mL烧杯中，置于磁力搅拌器上，将pH电极放到烧杯中合适的位置，边搅拌边用0.1mol/LNaOH溶液调整甲醛溶液pH8.5，备
10、用。在5mL发酵上清液中加45mL去离子水和3滴30%过氧化氢。在磁力搅拌下，用0.1mol/LNaOH溶液调整上述混合液的pH值为8.5。然后加入2mLpH8.5的甲醛溶液，反应3min，用0.01mol/L标准NaOH溶液滴定至pH8.5。记录消耗0.01mol/L标准NaOH溶液的体积。挥发性化合物的测定采用气相色谱法。样品前处理：准确移取7mL发酵上清液于顶空气相瓶中，加入1.4gNaCl固体和磁力搅拌转子，压盖器密封顶空瓶盖，放在磁力搅拌器（350r/min、45min）上使NaCl充分溶解，放置于进样槽。静态顶空气相色谱（headspacegaschromatography，HS-
11、GC）条件：安捷伦7697A顶空进样器，AgilentDB-FFAP色谱柱（30m0.25mm0.25m），检测器是氢火焰检测器（flameionizationdetector，FID），空气流量300mL/min，氢气流量30mL/min，载气（氮气）流量10mL/min。分流进样：分流比是101；进样量2L；样品平衡温度90；样品平衡时间30min；进样口温度250，检测器温度250。升温程序：初始温度40，保持10min，然后以5/min升至190，保持1min，接着以20/min升至230，保持2min。定性定量方法：选择含量较高和影响较大的7种挥发性化合物（乙醇、乙酸、乙醛、乙酸乙酯
12、、正丙醇、异丁醇、异戊醇）标准品，在上述色谱条件下进行分析，以各种挥发性化合物的色谱出峰时间作为样品组分的定性依据。将处理好的样品按上述色谱条件进行分析，以各挥发性化合物的色谱峰面积进行定量。1.3.6数据分析本研究的不同氮源发酵均采取两组平行，所有理化指标均为3个平行测定，实验结果为平行实验的平均值。实验数据均用SPSS24进行显著性分析。2结果与分析2.1不同氮源的葡萄酒发酵二氧化碳生成量在葡萄酒发酵过程中，伴随着二氧化碳的生成和排放，发酵体系的质量减少。因此，发酵系统减少的质量即二氧化碳生成量。通常用二氧化碳生成量衡量发酵状态。2.2不同氮源的葡萄酒发酵还原糖含量还原糖作为葡萄酒发酵的能
13、源和碳源，在发酵过程中逐渐被消耗，常用其含量变化衡量发酵进度。还原糖剩余量也影响最终葡萄酒的品质。2.3不同氮源的葡萄酒发酵甘油含量甘油无挥发性、无气味，不影响葡萄酒香气；具有甜味、黏性，有利于提高葡萄酒的质量。提高甘油含量会增加葡萄酒的甜味和黏度16。2.4不同氮源的葡萄酒发酵可同化氮含量可同化氮含量会影响发酵过程中酵母的生长和代谢，影响乙醇、甘油、酯类、乙酸、高级醇、乙醛和H2S等含量4。2.5不同氮源的葡萄酒发酵风味物质含量2.5.1乙醇含量YAN为180mg/L的不同氮源的葡萄酒发酵乙醇含量变化。2.5.2乙酸含量乙酸是酒精发酵的副产物，由酵母的异常代谢生成。由于其具有特殊气味和口味，
14、因此在葡萄酒中应控制乙酸含量，一般不宜超过1.2g/L20。YAN为180mg/L的不同氮源的葡萄酒发酵乙酸含量变化。2.5.3乙醛含量乙醛是酒精发酵过程中通过丙酮酸脱羧形成，随后被还原成乙醇。含量过高（80mg/L）会影响葡萄酒的品质12。YAN为180mg/L的不同氮源的葡萄酒发酵乙醛含量变化。2.5.4乙酸乙酯含量乙酸乙酯具有甜味和果香味，浓度过高时有刺激性气味，因此葡萄酒中乙酸乙酯含量不宜过高16。YAN为180mg/L的不同氮源的葡萄酒发酵乙酸乙酯含量变化结果见图8。由图8可知，酵母浸粉组和混合氨基酸组乙酸乙酯含量变化趋势基本相同。在发酵各个时期酵母浸粉组乙酸乙酯含量始终高于混合氨基
15、酸组，最终两组乙酸乙酯含量分别为46.05mg/L和32.35mg/L，差异显著（P0.05）。由于发酵过程中的乙酸乙酯是由乙酸和乙醇合成21，因此乙酸乙酯含量与乙酸含量变化趋势相似。2.5.5高级醇含量高级醇是酵母菌异常代谢的产物，普遍具有刺激性，含量在250350mg/L为宜，含量过高（550mg/L）时易使饮用者有“上头”感22。3结论本研究分别采用酵母浸粉和混合氨基酸为模拟葡萄汁发酵的可同化氮源，在可同化氮供应量均为180mg/L的情况下，两组的可同化氮消耗量也基本相同，分别为89.41mg/L和84.17mg/L。两组各生成物含量都在国标允许范围内15，24，与混合氨基酸相比，使用酵母浸粉还原糖消耗量增加130.47g/L，增加乙醇46.14g/L、甘油7.95g/L、
