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1、CMV 启动子 质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子 两大类，后者包括 CMV，SV40，T7, pMC1，PGK 启动子等。zhengzzh 对 CMV 和 T7 的来源做了介绍。 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters） 就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由 DNA 组 成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins） 结合而控制基因活
2、动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA 聚合酶 polymerases) 的 活动。这种酶制造着基因的 RNA 复制本。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。 T7 启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核 表达的首选，尤其以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。强大的 T7 启动子完全专一受控于 T7 RNA 聚合 酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合酶快 5 倍当二者同时存在时，宿 主本身基因的转录竞争不过 T7 表达系统，几乎所有的细胞资
3、源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小 时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50%以上。由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶，需要将外源的 T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而 T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了 T7 系统的调控模式非诱导条件 下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影 响；通过控制诱导条件控制 T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可 溶性部分。有几种方案可用于调控 T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控 T7 表达系统。1.噬菌体 DE3 是 lambda 噬菌体的衍生株，含有
4、lacI 抑制基因和位于 lacUV5 启动子下的 T7 RNA 聚合酶基因。DE3 溶源化的菌株如 BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和 lac 一样 都是 IPTG 诱导。2.另一种策略是用不含 T7 RNA 聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白 对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用 CE6 噬菌体侵染宿主细胞CE6 是 lambda 噬菌体 含温度敏感突变(cI857ts)和 pL/pR 启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的衍生株，在热诱导条件下可以激活 T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通
5、过共转化质粒提供 T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓 度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于 T7 RNA 聚合酶的 调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表 达水平；之二是采用带有 T7 lac 启动子的载体在紧邻 T7 启动子的下游有一段 lacI 操纵子序列编码 表达 lac 阻遏蛋白(lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上 T7 RNA 聚合酶前的 lacUV5 启动子并 抑制其表达，也作用于载体 T7 lac 启动子，以阻断任何 T7 RNA 聚合酶导致的目的基因转录。
6、pLacI 转化 也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制 T7 RNA 聚合酶的基因T7 溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有 pLysS 和 pLysE，相容的 ori 都不会 影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而 pLysE 会明 显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种 不同方法来巧妙调控 T7 聚合酶合成，T7 启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。 CMV：CMV 基因组有 229kb，属疱疹病毒亚 科。CMV DNA 只有一
7、个单向性的 IE 启动子复合体，可指导多 个基因的表达1。在 IE94 基因上游存在一个强启动子，IE94 的上游区比SV40 病毒的 72bp 重复序列具有 更高的增强子功能。IE94 基因启动子区序列分析证明这一区段内有多个回文结构，并相间着保守的序列。 在这一区段的-50-580bp 之间至少有 4 套 1318bp 的重复序列。IE1 和 IE2 蛋白的表达受增强子的调控， 此增强子也称为主要增强子立即早期启动了一增强子、IE1/IE2 增强子或 CMV 增强子，是上游调节区复合 体的一部分。因集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，并且在多种类型的细胞的影响条件下 均有活性。根
8、据对基因表达的影响可将此增强子分为 3 个区。在 CMV 感染中，增强子调控的表达先激活后 抑制。在 CMV 复制早期可诱导 NF-B、AP-1 和 CREB/ATF 等细胞转录因子与增强子中多位点结合。感染后 可诱导产生 NF-kB 和 aP-1。在感染晚期，ATF 的结合受影响，其活性受病毒基因产物的调节。 CMV 启动子/增强子被广泛应用于构建高效真核表达载体，用于基因工程、基因治疗和 DNA 免疫9。,1,用基因小鼠分析 CMV 增强子活性，其主要立即早期启动子（MIEP）的转录活性可能部分决定病毒在子宫内 特异性感染胎儿组织的能力10。MIEP 不是广泛特异性的启动子，因在转基因小鼠
9、中，表达由 MIEP 调控 的报告基因的组织和CMV 自然感染的组织一致的,CMV 是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子。也可以作为 II 型启动子启动 shRNA 的表达。但是它的启动效应不会被六个 T 终止，所以如何构建启动 shRNA 的表达的 CMV 启动子是一个非常有意义的话题。 同时，相比较 H1/u6 启动子是属于原核启动子，在真核细胞里面的启动效率非常低，所以介 导的干扰效应也是非常有限的。研就、推广 CMV 启动子介导干扰效应，意义重大，希望大家 踊跃提出宝贵意见，相互交流，共同提高！ 搞笑： 商业公司的载体上的 H1 和 U6 启动子不是人源就是鼠源的； CMV
10、启动子用来表达 shRNA 序列只是 Ambion 公司的产品有，而且是修饰过的 CMV 启动子，不是常见的。 感爱好,最近 也在看shRNA的问题,关 于 II 型 启动子,我看到 国内吉凯 基因(genechem)公司推出了一系列 的该型载体-pGCLM 系列载体,使用的是 CMV 等 polII 识别的启动子, 没用过, 想问问用过的/有经验的 大侠,效果怎样? 另外, 我看吉凯的 shRNA 载体的 MCS 是插在报告基因后的一段microRNA 结构序列中间, 不太清楚 microRNA 结构序列是指的什么, 我们自己设计的shRNA 不就是参照内源的miR30-a 结构设计的么?
11、请求高手解惑. 3X A LOT. 另,请教楼上大侠和各位, 表达 siRNA 的 CMV 启动子和我们常说的 CMV 启动子有什么不同? “H1 和 U6 启动子不是人源就是鼠源的” 确实如此，但是它是一种启动效果比交差的启动子。比起 CMV 启动子地启动效率要差。 请教楼上大侠和各位, 表达 siRNA 的 CMV 启动子和我们常说的 CMV 启动子有什么不同? 给你说一种方法，自己去找答案： 1。找 ambion 公司网站，把 CMV 序列根据位点找出来。 2。找 invitrogen 或者 promege 公司网站，把真核表达载体的 CMV 序列找出来。 3。对比。 这样，不就知道了？！要学会自己学习！ 位点差异当然知道怎么比, 但是具体使用上为什么这些点突变, 还有就是可不可以互换, 感谢您费这么大 劲儿教我比对, 但是学习不仅要知其然,更要知其所以然! 这是一个非常有意思的话题，我曾经比对过 ambion 的 pSilencer4.1 和真核表达的 CMV，具体结果忘记了， 但是差异很小。希望各位有爱好的或者有研究的同仁多多发表高见！,2,
