实验五 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量 一：目的 了解 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理 掌握总糖定量测定的操作方法 二：原理 还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖 （如麦芽糖）它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇遇氧化剂时，具 有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物黄色的 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身 被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸在一定范围内，反应液里棕红色的深 浅与还原糖的含量成正比，在波长为 540nm 处测定溶液的吸光度，查对标准曲线 并计算，便可求得样品中还原糖的含量 对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水 解法将它们彻底水解成单糖再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量 由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入 的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以,COOH,OH,NO2,O2N,,,,,,,,,,,,,,,,还原糖,,,,（碱）,COOH,OH,O2N,NH2,,,,,,,,,,,,,,3,5-二硝基水杨酸 （黄色）,3-氨基-5-硝基水杨酸 （棕红色）,,,,,,,,,,,,HC OH,C OH ( HC OH)n H2C OH,,,,,,,,,（碱） 加热,1,烯二醇,O C OH HC OH ( HC OH)n H2C OH 糖酸,,,折算系数（1- 18 = 0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。
180 三：实验材料及设备 1、材料：面粉 2、仪器：分光光度计 电子天平 沸水浴 3、器材： 刻度试管： 25mL8 容 量 瓶： 100mL2 锥 形 瓶： 100mL1 移 液 管 ： 1mL2 2mL2 10mL2 烧 杯 ： 250mL1 50mL1 滴 管 ： 2 洗 耳 球： 2 滤 纸：11cm 坐 标 纸 漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各 1 四：试剂的配制 1、葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置 80烘箱内约 12 小时准确称取 500mg 葡萄糖于 烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至 500mL 容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中 4 保存期约一星期）若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配 制 2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS 试剂） 将 5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于 200mL 2N NaOH 溶液中（不适宜用高温促 溶），接着加入 500mL 含 130g 酒石酸钾钠的溶液，混匀再加入 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至 1000mL暗处保存备用 3、碘液 称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100mL 水中。
4、酚酞指示剂 称取 0.1g 酚酞，溶于 250mL 70%（V/V）的乙醇中2,3,5、HCl 溶液（6N） 取 500mL12NHCl，用水稀释至 1000mL 6、NaOH 溶液（6N） 取 240gNaOH，加水溶解，定容至 1000mL 五：操作步骤 1、样品中总糖的提取 (1) 取材：称取 0.7g 面粉，准确记录实际质量（W），放入 100mL 锥形瓶中 (2) 溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入 15mL 蒸馏水；再加入 10mL 6N HCl， 搅匀 水解：置于沸水浴中水解 30 分钟用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中， 加 1 滴碘液，检查淀粉水解程度如显蓝色，表明未水解完全，应继 续水解如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶， 冷却 中和：加 1 滴酚酞指示剂，加入 10mL 6N NaOH 中和至微红色 (5) 定容：将溶液转移至 100mL 容量瓶（B1）中，定容 过滤：用滤纸过滤注意，滤纸不能用蒸馏水湿润 稀释：精确吸取滤液 10mL，移入另一个 100mL 容量瓶（B2）中，定容B2）液 作为总糖待测液备用 2、标准曲线制作及样品测定 取 8 支 25mL 刻度试管，按下表所示顺序操作。
4,六：结果处理： 由 05 号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540 为纵坐标，在坐标纸 上绘制标准曲线； 求两个样品管A540 的平均值A 540； 由A 540 从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)； 计算你所取的生物材料中总糖的百分含量。