植物组织直接PCR试剂盒

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1、 Page 1 Phire植物组织直接 PCR 试剂盒 产品货号： F-130， 200rxns x 50l 稀释缓冲液可足够用于 250 个稀释反应（ 20l） -20 保存，有效期为 1 年。稀释缓冲液一旦解冻，可放于 4 保存。 1. 简介 Thermo Scientific Phire 植物组织直接 PCR 试剂盒可以直接对植物叶片和种子进行 PCR，而无需进行 DNA 的纯化。 无论是 新鲜植物 还是 4 贮存或者冻存 的植物都可作为模板材料 。此外， 贮存在诸如Whatman 903和 FTA 卡片上的植物材料也可作为模板材料。用此试剂盒测试过的植物样本列表见我们的网站： . P

2、hire 植物组织直接 PCR 试剂盒中所配备的聚合酶是 Phire 热启动 II DNA 聚合酶。该酶是一种特殊的工程酶，融合有 DNA 双链结合蛋白 ，不但聚合能力强，而且对 多种 植物组织中 的 PCR 抑制剂表现出超强的抵抗力。 Phire 植物组织直接 PCR 试剂盒包含了适用于直接法和稀释法两种 实验方案 的试剂和工具。为了便于处理样品，试剂盒配备了一个 0.5mm 的 Harris Uni-CoreTM 取样器和配套的 Harris 切片垫。 试剂盒还带有稀释缓冲液用以 PCR 前的样本处理， （详见第 4 部分的 “稀释操作流程 ”）。 稀释缓冲液可用以 处理 较 大或困难 的

3、 样本（例如含有较多纤维或者乳胶成分的样本）， 当需要对 一个样本进行多 次 PCR 时也需要使用 稀释缓冲液。 另外，当 扩增 子 1kb 时，使用稀释法 是一个不错的选择。此外，该试剂盒还带有 对照引物 用以 扩增植物叶绿体 DNA1 高度保守区域。此产 品推荐用来做终点 PCR。 2. 包装信息 组分 F-130 Phire 热启动 II DNA 聚合酶 200 l 2x Phire植物 PCR 缓冲液 (包含 dNTPs and MgCl2) 5 x 1 ml 对照引物混合物（每种 25 M） 40 l 稀释缓冲液 5 ml Harris Uni-CoreTM 0.50 mm 取样器

4、1 Harris TM 切片垫 1 材料安全数据表见 3. PCR 操作指南 使用前请对各管小心混匀并离心，以保证均质，提高产物得率。 PCR 体系的建立可在室温下完成。注意：请于最后将样品加到反应体系中。请参照第节的样品处理指南。 重要提示 对两个或者两个以上的样品进行取样时，每两个样品之间， 需 清洁取样工具，详见 4.2。 将样品直接加入 PCR 反应液中而不是空白管中 。 对于困难样本、长片段扩增和多 次 PCR，请使用稀释法 。 请使用 98 进行变性 。 退火温度与众多常规 DNA 聚合酶（如 Taq DNA聚合酶）不同， 详见 6.2。 延伸时，若扩增子片段 1kb，则按 20

5、s/kb 设定延伸时间 。 Page 2 表 1. 加样指南 组份 20l 反应 体系 50l 反应 体系 终浓度 H2O 定容至 20 l 定容至 50 l 2x Phire植物PCR 缓冲液 10 l 25 l 1x 引物 A x l x l 0.5 M 引物 B x l x l 0.5 M Phire热启动II DNA 聚合酶 0.4 l 1 l 样本量（详见第 4 部分） 直接法： 稀释法： 0.5mm 的小块 / 小种子 0.5 l 0.5mm 的小块 / 小种子 1.25 l 表 2. 循环扩增程序推荐 循环 步骤 两步法 三步法 循环数 温度 时间 温度 时间 起始变性 98 5

6、min 98 5min 1 变性 退火 （ 详见 6.2） 延伸（详见 6.3） 98 - 72 5s - 20s 1kb 20 s/kb 1 kb 98 X 72 5 s 5 s 20s 1kb 20 s/kb 1 kb 40 最后延伸 72 4 1 min 保持 72 4 1 min 保持 1 4.样品处理指南 为了获得小且均一的样本，我们推荐使用试剂盒里提供的 Harris 取样工具。 受 取样材料厚度和坚固度的 影响 ， Harris 取样器 可 重复使用 的次数有所不同，最多可 达 500 次。如果取样器被再次使用，为了防止样品间的交叉污染，正确清洁取样器的切割刃口是非常重要的（详见

7、 4.2 的清洁说明）。 Harris切片垫为 Harris 取样器提供最好的 承载 平面，它由具有自我修复功能的惰性材料制成，有两个 承载 表面。该切片垫 可 重复使用数百次，为了防止交叉污染，当用其处理不同样本时，在处理完一个样本后一定要对其进行清洁再用于另一个样本的处理（详见 4.2）。 Harris 取样工具可从我公司另行购买。 4.1 Harris 取样器的使用 Harris 取样器的刃口非常锋利，因此使用该工具时要倍加小心。请遵循以下操作指南使用该取样器： 1. 将样本置于 Harris 切片垫上。 2. 小心去除取样器刃口上的保护帽。 3. 紧握打孔器，向下推刃口 使 其进入样本

8、，然后反方向旋转打孔器，直到穿过样本。 整个操作 只需要轻柔 下压即可 。 该操作过程中 请不要压上部的活塞。 4. 上提取样器，将其从样本上移开。然后按压活塞将已取 到 的样本小块注射到 PCR 反应液中。确保样本 置于 PCR 反应 体系 中，而没有粘在管壁上。 5. 每处理完一个样本后请清洗取样器和切片垫，方法如 4.2 中所述。 您可以 在这个网址： 4.2 取样工具的清洁 为了防止样本间的交叉污染，每处理完一个样本， 都需要 对取样器的切割刃口进行清洁：将刃口浸入 2%的次氯酸钠溶液中，上下抽压活塞 进行冲洗，然后用干净的纸巾擦干残液。切片垫在每次取样后也应用 2%的次氯酸钠冲洗。

9、 建议在所有实验中，都增加一个没有 DNA 模板的阴性对照。为了检测交叉污染，可将 清洗后 的打孔器浸入到阴性对照样本中（详见 7.3）。关于使用Harris 取样器时，如何避免交叉污染的更多的信息请参考 页面上的应用操作指南部分。 4.3 植物叶片 a）直接法： 使用 0.5mm 的 Harris 取样工具从植物叶片上取一个样本 ，并 将所取的样本直接加入到 PCR 反应 体系 中（ 20-50l 体系）。 注意， 确保样品处于 PCR 溶液中 ，而非贴在管壁上，并尽量 使用嫩叶片 样本 。尽管 4 或者冷冻条件下的植物材料和贮存在诸如 Whatman 903 和 FTA 卡片上的植物材料

10、都可 作为模板 ，但新鲜的植物材料 还 是最好的 Page 3 选择。 如果用直接 PCR 法进行 长片段和 复杂 样本 的扩增， 取 0.35mm 大小的样本作 模板 有助于获得更好的结果。 0.35mm 的 Harris 取样器（ F-180S/L）可单独购买。 b）稀释法： 像直接法一样，在稀释法中我们也推荐使用嫩叶片。取一小块叶片（直径大约 2mm），将其置于 20l 稀释缓冲液。 用 100l 枪头 挤压叶片以捣 碎样本。 如果叶片组织的使用量较大（请勿超过 1mg），请将稀释缓冲液的体积增加到 50l。叶片捣碎后，溶液应该呈现绿色。短暂离心后，取 0.5l上清加入 20l PCR

11、反应液中充当反应模板。所取上清体积会随着植物材料和所加稀释液体积的不同而有所不同。 4.4 植物种子 a）直接法： 先用干净的解剖刀除去种皮，然后在切片垫上切下如右黑点 ( )大小的种子样本，再将样本直接加入到 PCR 反应体系中（ 20-50l）。提示：推荐使用去 除 种皮的种子。对于异常小的种子（如拟南芥的种子），可直接将 1-2 粒完整的种子加入到 PCR 反应液中。 b）稀释法： 用解剖刀切极少量已去种皮的种子，如右黑点 ( )大小即可。然后将切下的样本直接加入到 20l 稀释缓冲液中。简短 涡旋 振荡后于室温放置 3 分钟。确保种子样本浸没在稀释缓冲液中。短暂离心后，取 0.5l 上

12、清加入 20l PCR 反应液中充当反应模板。 4.5 贮存在 滤纸 卡（如 Whatman 903 and FTA卡）上的植物材料 a）直接法： 使用 0.5mm Harris 取样器从样品贮存卡上切取一小块样本，将其直接加入 50l PCR反应液中。对于长片段扩增和困难样本，取 0.35mm大小的样本作起始材料有助于获得更好的结果。0.35mm 的 Harris 取样器（ F-180S/L）可单独购买。 5. 各反应组分说明 5.1 酶 Phire 热启动 IIDNA 聚合酶具有 53DNA 聚合酶活性和弱的 35外切酶活性。用 Phire 热启动酶扩增所得产物为平末端，故我们推荐使用平末

13、端克隆。如果需进行 TA 克隆，可以使用 DyNAzymeTM IIDNA 聚合酶（ F-501）给平末端 PCR 产物加 A 尾，其 操 作 指 南 可 在 我 们 的 相 关 网 站 上 找 到（ )。 5.2 Phire 植物 PCR 缓冲液 试剂盒中所配备的 2x Phire PCR 缓冲液已经针对植物材料进行过严格优化。它包含了 dNTPs 和终反应浓度为 1.5mM 的 MgCl2。 5.3 稀释缓冲液 稀释缓冲液 也 经过严格优化，可从众多不同的植物样本叶片和种子中释放 DNA。该缓冲液也适用于在 4 短期贮存 DNA 样本。对于长期贮存，推荐将上清转移到一个新管中，然后再将其贮

14、存在 -20 。稀释缓冲液足够用于 250 个稀释反应（ 20l 体系 /反应 ）。 5.4 引物 引物的终浓度推荐使用 0.5M。引物 Tm 值的计算结果会随着使用方法的不 同 而有所不同。请使用我们网站上（ )的 Tm 计算器和操作指南计算引物的 Tm 值 , 进而确定合适的退火温度。 6. 循环条件说明 6.1 初始变性 使用直接 PCR 法，初始变性时间需要延长到5min，以使细胞裂解，基因组 DNA 释放。 6.2 引物退火 注意 ,Phire 热启动 II DNA 聚合酶最佳的退火温度与 其他 基于 Taq 的聚合酶有着明显不同。请使用我们相关网站（ )上的 Tm 计算器 Page

15、 4 和操作指南确定特定引物的 Tm 值和最适的退火温度。设置引物退火温度的基本原则是：若引物 20nt，则退火程序设置为： Tm+3 ， 5s，该 Tm 值指两引物中较低的那一个 Tm 值；若引物所含碱基数 20nt，则直接使用两引物中较低的那一个 Tm 值作为退火温度。如果有必要，可以使用温度梯度找到每一对模板 /引物的最适退火温度。退火梯度 可以 扩展到延伸温度（两步法 PCR）。对于 Tm 值较高的引物对（ Tm至少在 69-72 之间 ），建议 使用无退火步骤的两步法循环。 6.3 延伸 延伸在 72 下进行。对于片段 1kb 的扩增子，延伸时间建议设置成 20s，对于片段 1kb 的扩增子，延伸时间建议按照 20s/kb 进行设置。 7. 对照反应 7.1 直接 PCR 的对照反应使用对照引物混合物 我们建议无论使用直接法还是稀释法进行直接 PCR 实验，最好设置对照反应。对照引物随试剂盒