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1、QPCR 原理及应用 由于 Real-time qPCR 的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技 术。越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验，也基本上被 real-time qPCR 所代替。由于 real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测，很多没 有做过 real-time qPCR 的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些 做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从 real-time qPCR 的发展史说起，包括 real-time qPCR 的原理，实验设 计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教
2、你从各个方面了解 real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR 发展史 Real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行 实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存 在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的 PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生 命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测， 药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在 Real-time qPCR 技
3、术的发展过程中，定量PCR 仪的发展起了至关重要的 作用。1995 年，美国 PE 公司（已经并入 Invitrogen 公司）成功研制了 Taqman 技术，1996 年推出了首台荧光定量 PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强 度，通过 Ct 值进行数据分析。从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。现在的定量 PCR 仪有 ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、 PRISMStepOneTM 系列；BIO-RAD 的 CFX96、iCycler iQ5、MyiQ、MJ Research Chromo4TM Opticon
4、 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler系列； Eppendorf Masercycler；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler和 BIOER 的 LineGene 系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新 鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的 real-time PCR 仪器生产比如西安天隆科技公司的 TL 系列仪器。,1,二、Real-time qPCR 概述 Real-time qPCR 原理 实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，
5、对 PCR 进程进行实时检测。 一般来讲，定量 PCR 仪包括：实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台、基因扩增热 循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。 其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型 号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是 这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控 制系统组成。 常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和 LED；荧光检测元件常用两种方式： 光电倍增管和冷光 CCD 摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时 PCR 扩增过 程中，荧光信号被收集，转化
6、为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光 阈值和 Ct 值。 Real-time qPCR 的数学原理 首先来看一个 real-time qPCR 中的重要参数Ct 值（Ct value），阈值 （threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第 3-15 个循环的荧光值就是 基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的 10 倍。在 实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct 值就是荧光值达到阈值时 候的 PCR 循环次数。所以是一个没有单位的参数。 那么为什么说 Ct 值跟初始模板的量成反比呢？我们来看 PCR 的扩增方程：,2,从线性方程上看，斜率
7、（slope）为-1/lg(1+E)，所以 E=10-1/slope-1。如 果从标准曲线上得到斜率（-3.3），就可以算出扩增效率（0.99）。一般来讲 PCR 扩增效率在 90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于 100%，是由于 PCR 反应中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二 聚体造成。,3,Real-time qPCR 的种类 根据 real-time qPCR 的化学发光原理可以分为 2 大类：一类为探针类，包 括 TaqMan探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增 加；一类为非探针类，其中包括如 SYBRGreen
8、I 或者特殊设计的引物(如 LUXPrimers) 通过荧光染料来指示产物的增加。 Taqman探针法 Taqman探针是最早用于定量的方法。就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5端标记一个报告荧光基 团，3端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬 灭基团吸收，也就是 FRET 反应；PCR 扩增时，Taq 酶的 5-3外切酶活性将探针 酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧 光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积 与 PCR 产物形成完全同步。而新型
9、TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量 分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选 技术平台。,3.2 分子信标法 分子信标：一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在 此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分 子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬,4,灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模 板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分
10、子信标 的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长 的光子。,3.3 SYBRGreen 法 SYBRGreen I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料，与双链 DNA 结合 后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen I 的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。在 PCR 反应体系中， 加入过量 SYBRGreen 荧光染料，SYBRGreen 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链 后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBRGreen 染料分子不会发射任何荧光信 号，从而保证荧光信号的增加与 PCR
11、产物的增加完全同步。,3.4 LUXPrimers 法,5,LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项 新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3端用荧光报告基团标记。在没有单 链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断 的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。,4. Real-time qPCR 和常规 PCR 的区别 实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测 敏感性高 需要样品少 特异性高 精确定量 三、Real-time qPCR 实验设计 实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍
12、，节省时间！ 尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验 路线。当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分 析原因，才有可能创新。对于一个 real-time qPCR 而言，首先就是实验材料的 处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的 50%； 进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。 1. 实验材料的处理和准备 以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组（CON）和处理组 （TRT）。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收 集过程中，尽量避免 RNA 的降解（尤其对于绝对定量的样品）。,
13、6,7,一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低 温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。现在新技术的发展， 也有一些非液氮类的样品储存液 ，比如百泰克的 RNAfixer 。 2. 引物设计 一般 real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则： 扩增产物长度在 80-150bp。 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 产物长度一般在 15-30 碱基之间。 G+C 含量在 40%-60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 引物 5端可以修饰。 引
14、物 3端不可修饰。 引物 3端要避开密码子的第 3 位。 Taqman探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。遵循下面以下原则： 尽量靠在上游引物； 长度 30-45bp，Tm 比引物高至少 5； 5端不要是G，G 会有淬灭作用，影响定量 四、Real-time qPCR 操作过程 1. RNA 提取和反转录 在抽提 RNA 过程中任一环节的不正确操作都可能导致 RNA 酶的污染。由于 RNA 酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循 下面一些原则： 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染 RNA 的抽提 并成为 RNA 酶的来源。培养良好的微生物实验操
15、作习惯预防微生物污染。 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA，避免使用公共仪 器所导致的 RNA 酶交叉污染。例如，使用 RNA 探针的实验室可能用 RNA 酶 A 或,8,T1 来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含 RNA 酶。 3. 在提取裂解液中，RNA 是隔离在 RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操 作会要求用无 RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150C 的烘箱中烘烤 4 小时。塑料器皿可以在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟，用水彻底漂 洗干净后高压灭菌备用。 当然，这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全
16、可以用初次开封的离 心管和枪头，新过滤的超纯水，进行 RNA 的提取。 2.Mix 配制 一般来讲，进行 real-time qPCR MasterMix 都是 2的浓缩液，只需要加 入模板和引物就可以。由于 real-time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做 3 个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于 Ct 相差较多或者 SD 太大，无法进 行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为 100-400mM；模板如果是总 RNA 一般是 10ng-500，如果 cDNA，通常情况下是 1ul 或者 1ul 的 10 倍稀释液，要根 据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要 根据所用 MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在 反应体系配置过程中，有下面几点需要注意： MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在 4 度。 更多的配制 Mix 进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！ 所有成分加完后，离心去除气泡。 每
