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1、QPCR 原理及应用 由于 Real-time qPCR 的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技 术。越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验,也基本上被 real-time qPCR 所代替。由于 real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测,很多没 有做过 real-time qPCR 的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手;甚至一些 做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑,不知所措。 本文就从 real-time qPCR 的发展史说起,包括 real-time qPCR 的原理,实验设 计,实际操作,数据分析,常见问题解答五个方面,手把手教
2、你从各个方面了解 real-time qPCR,彻底的从菜鸟到高手! 一、Real-time qPCR 发展史 Real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中,通过荧光信号,对 PCR 进程进行 实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期,模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存 在线性关系,所以成为定量的依据。由于常规的 PCR 的缺点,real-time qPCR 由于其操作简便,灵敏度高,重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生 命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,SNP 检测,等位基因的检测, 药物开发,临床诊断,转基因研究等。 在 Real-time qPCR 技
3、术的发展过程中,定量PCR 仪的发展起了至关重要的 作用。1995 年,美国 PE 公司(已经并入 Invitrogen 公司)成功研制了 Taqman 技术,1996 年推出了首台荧光定量 PCR 检测系统,通过检测每个循环的荧光强 度,通过 Ct 值进行数据分析。从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。现在的定量 PCR 仪有 ABI7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、 PRISMStepOneTM 系列;BIO-RAD 的 CFX96、iCycler iQ5、MyiQ、MJ Research Chromo4TM Opticon
4、 系列;Stratagene MxTM 系列;Roche LightCycler系列; Eppendorf Masercycler;Corbett Rotor-GeneTM;Cepheid SmartCycler和 BIOER 的 LineGene 系列。 随国内生命科学的快速发展,科研水平不断提高,发高水平文章已不再是新 鲜事。与其同时,国内公司经过长期不懈的努力,也有自主研发的 real-time PCR 仪器生产比如西安天隆科技公司的 TL 系列仪器。,1,二、Real-time qPCR 概述 Real-time qPCR 原理 实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中,通过荧光信号,
5、对 PCR 进程进行实时检测。 一般来讲,定量 PCR 仪包括:实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台、基因扩增热 循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。 其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同,不同厂家不同型 号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是 这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控 制系统组成。 常用的荧光激发方式有两种:卤钨灯和 LED;荧光检测元件常用两种方式: 光电倍增管和冷光 CCD 摄像机,光单色元件有滤光片和光栅。在实时 PCR 扩增过 程中,荧光信号被收集,转化
6、为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线,荧光 阈值和 Ct 值。 Real-time qPCR 的数学原理 首先来看一个 real-time qPCR 中的重要参数Ct 值(Ct value),阈值 (threshold),和基线(baseline)。一般来讲,第 3-15 个循环的荧光值就是 基线,是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的 10 倍。在 实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。Ct 值就是荧光值达到阈值时 候的 PCR 循环次数。所以是一个没有单位的参数。 那么为什么说 Ct 值跟初始模板的量成反比呢?我们来看 PCR 的扩增方程:,2,从线性方程上看,斜率
7、(slope)为-1/lg(1+E),所以 E=10-1/slope-1。如 果从标准曲线上得到斜率(-3.3),就可以算出扩增效率(0.99)。一般来讲 PCR 扩增效率在 90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于 100%,是由于 PCR 反应中存在抑制因素;而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二 聚体造成。,3,Real-time qPCR 的种类 根据 real-time qPCR 的化学发光原理可以分为 2 大类:一类为探针类,包 括 TaqMan探针和分子信标,利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增 加;一类为非探针类,其中包括如 SYBRGreen
8、I 或者特殊设计的引物(如 LUXPrimers) 通过荧光染料来指示产物的增加。 Taqman探针法 Taqman探针是最早用于定量的方法。就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸:5端标记一个报告荧光基 团,3端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬 灭基团吸收,也就是 FRET 反应;PCR 扩增时,Taq 酶的 5-3外切酶活性将探针 酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧 光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积 与 PCR 产物形成完全同步。而新型
9、TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量 分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选 技术平台。,3.2 分子信标法 分子信标:一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在 此发夹结构中,位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分 子信标的茎环结构中,环一般为 15-30 个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般 5-7 个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端,而淬,4,灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计,以致于在复性温度下,模 板不存在时形成茎环结构,模板存在时则与模板配对。与模板配对后,分
10、子信标 的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时,它发出自身波长 的光子。,3.3 SYBRGreen 法 SYBRGreen I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料,与双链 DNA 结合 后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen I 的最大吸收波长约为 497nm,发射波长最大约为 520nm。在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBRGreen 荧光染料,SYBRGreen 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链 后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBRGreen 染料分子不会发射任何荧光信 号,从而保证荧光信号的增加与 PCR
11、产物的增加完全同步。,3.4 LUXPrimers 法,5,LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项 新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3端用荧光报告基团标记。在没有单 链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。在有目标片断 的时候,引物与模板配对,发夹结构打开,产生特异的荧光信号。,4. Real-time qPCR 和常规 PCR 的区别 实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测 敏感性高 需要样品少 特异性高 精确定量 三、Real-time qPCR 实验设计 实验设计其实比实验本身更重要!好的实验设计可以事半功倍
12、,节省时间! 尤其做生物实验,一定要查询尽可能完全的相关资料,整理好思路,设计好实验 路线。当然实验过程中出现各种各样的变化,但有足够多的背景知识,就可以分 析原因,才有可能创新。对于一个 real-time qPCR 而言,首先就是实验材料的 处理和准备;然后引物设计,这步至关重要,好的引物是实验本身成功的 50%; 进行实验和数据分析(这一部分单独说明)。 1. 实验材料的处理和准备 以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组(CON)和处理组 (TRT)。组内要有生物重复,可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收 集过程中,尽量避免 RNA 的降解(尤其对于绝对定量的样品)。,
13、6,7,一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻,然后迅速转移到超低 温冰箱保存,但这种方法携带不方便,由于对于异地取材。现在新技术的发展, 也有一些非液氮类的样品储存液 ,比如百泰克的 RNAfixer 。 2. 引物设计 一般 real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则: 扩增产物长度在 80-150bp。 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 产物长度一般在 15-30 碱基之间。 G+C 含量在 40%-60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 引物 5端可以修饰。 引
14、物 3端不可修饰。 引物 3端要避开密码子的第 3 位。 Taqman探针的设计稍有不同,一般有公司设计合成。遵循下面以下原则: 尽量靠在上游引物; 长度 30-45bp,Tm 比引物高至少 5; 5端不要是G,G 会有淬灭作用,影响定量 四、Real-time qPCR 操作过程 1. RNA 提取和反转录 在抽提 RNA 过程中任一环节的不正确操作都可能导致 RNA 酶的污染。由于 RNA 酶的活性很难完全抑制,预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循 下面一些原则: 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染 RNA 的抽提 并成为 RNA 酶的来源。培养良好的微生物实验操
15、作习惯预防微生物污染。 使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA,避免使用公共仪 器所导致的 RNA 酶交叉污染。例如,使用 RNA 探针的实验室可能用 RNA 酶 A 或,8,T1 来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可能富含 RNA 酶。 3. 在提取裂解液中,RNA 是隔离在 RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操 作会要求用无 RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150C 的烘箱中烘烤 4 小时。塑料器皿可以在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟,用水彻底漂 洗干净后高压灭菌备用。 当然,这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全
16、可以用初次开封的离 心管和枪头,新过滤的超纯水,进行 RNA 的提取。 2.Mix 配制 一般来讲,进行 real-time qPCR MasterMix 都是 2的浓缩液,只需要加 入模板和引物就可以。由于 real-time qPCR 灵敏度高,所以每个样品至少要做 3 个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于 Ct 相差较多或者 SD 太大,无法进 行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为 100-400mM;模板如果是总 RNA 一般是 10ng-500,如果 cDNA,通常情况下是 1ul 或者 1ul 的 10 倍稀释液,要根 据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要 根据所用 MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在 反应体系配置过程中,有下面几点需要注意: MasterMix 不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在 4 度。 更多的配制 Mix 进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样! 所有成分加完后,离心去除气泡。 每