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1、Western blot 试验操作步骤一、 蛋白样品制备1 用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉） ，用吸管将其吸至离心管中2 用 4预冷的 PBS 1ml 冲洗培养瓶 2 次收集入上述离心管中3 1000rpm，离心 10min4 倒掉上清，沉淀用 1ml PBS 重悬，转入 EP 管中，再加 1ml PBS 冲洗离心管壁上残留的细胞转入 EP 管中 5 4，4000rpm ，离心 5min6 倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净）7 配制裂解液，计算所需用量，每个 EP 管中加入 100ul 裂解液 (10mg 组织/100ul)若有 4 管（4 组） ，配制 400ul 裂解液：PMSF
2、储备液浓度 100mM，用 RIPA 稀释至 1Mm. 【单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L TrisHCl（pH8.0 ）2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ; 蒸馏水至 50ml; 混匀后 4保存】8 4 裂解 30-45min，每 5min 振荡一次 9 4 14000g 离心 5min，取上清（移入 1.5ml 的 EP 管中） 。10 蛋白定量（常用 BCA 法，参见蛋白定量试剂盒使用说明）每管蛋白一致，分装约 20ul/管左右（加入 5buffer 并用 RIPA 稀释成 1） 11 将蛋白样 100，变性 5min， ，-80（or -
3、20）保存。二、SDS-PAGE 的配制：1 试剂及配制：（1）30% 丙烯酰胺：丙烯酰胺 29g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺 1g，去离子水至 100ml，过滤，避光，4贮存。（2）1. 5mmol/L Tris 溶液（PH8.8）：称取 18.15gTris 碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯 )调 pH 值至 8.8，加超纯水定容至 100 ml，室温储存。（3）1.0mmol/LTris 溶液（pH6.8）：称取 12.1gTris 碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯 )调 pH 值至 6.8，加超纯水定容至 100 ml，室温储存。（4）10%SDS ：1g
4、 SDS 加入 10ml 去离子水，室温贮存。（5）10% 过硫酸铵溶液：0.1g 过硫酸铵加入 1ml 水，4保存，现用现配。（6）TEMED （可购买成品）（7）5电泳缓冲液(Tank buffer)：称取 15.14g Tris 碱(分析纯)，72.1g 甘氨酸(分析纯)，5g SDS(分析纯 )，加适量的超纯水溶解，pH 值应该在 8.3 左右，加超纯水定容 1000ml，室温储存。（8）分离胶、浓缩胶液配方：（两个用小烧杯，用完立即刷）总体积 5ml 2ml 5ml浓度 12%分离胶 5%浓缩胶 10%分离胶水(ml) 1.6 1.4 1.930%丙烯酰胺(ml) 2.0 0.33
5、1.71.5mmol/L Tris 溶液(pH8.8)(ml)1.3 1.31.0mmol/L Tris 溶液(pH6.8)(ml) 0.25 10%SDS(ml)（透明） 0.05 0.02 0.0510%过硫酸铵溶液(ml) 0.05 0.02 0.05TEMED(ml)（铺胶前加） 0.002 0.002 0.0022. 制胶程序：（小分子量）（1） 装板（小玻璃朝外）（2） 配制分离胶，加 TEMED 后，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，从一边开始，并为浓缩胶留足够空间（梳齿长约 1cm） 。立即覆盖蒸馏水至顶部，天冷可放入烤箱 15-20 分钟，待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再
6、灌入浓缩胶（配方见上表） ，插入样品梳，避免气泡出现。（3） 待聚合后（约 20 分钟） ，拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽的前后槽，在加样孔中加入 10-20ul 样品（蛋白量 20ug 左右） 。左侧第一孔加 maker，样品不够可用 laoding buffer。电泳：接通电源，浓缩胶 80 伏约半小时，此后分离胶 120/160 伏继续 1 小时左右。三、转膜：1、转移缓冲液的配制：（先用先配）试剂 用量甘氨酸 14.413gTris 碱 3.0285g无水甲醇 40-200ml（蛋白量 150 以上加40）水 至 10002、 转膜程序：（1）剪 4 张滤纸，和一张 PVDF 膜，
7、大小与凝胶相同（滤纸要比胶小，膜稍大以防转膜时发生短路） 。在膜的一角做一记号（或剪角） 。（2）将剪好的膜依次序浸入 100%甲醇（10 秒）去离子水（5min）转移缓冲液（大于10min） 。（3） 滤纸和海绵（纤维）垫浸入转移缓冲液中（大于 10min）（4） 剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。（5） 安装转膜装置：从正极（红色）负极（黑色）依次为：白色边盒多孔垫片（12张）滤纸PVDF 膜凝胶（12 张）滤纸多孔垫片黑色边盒。扣上吊扣后插进转膜槽中。转膜槽内加冰盒，防止电泳时过热。（6）接通电源：恒流电转移两个小时，电流一般是 100mA（视蛋白大小而定） 。（7）电泳结束后，
8、关闭电源，将膜取出。四、封闭及免疫反应（一）试剂的配制：15x TBS：（ PH 7.5）用时稀释 5 倍试剂 1000ml 用量Tris-base 6.05gNaCl 43.83g去离子水 至 1000ml21x TBST ：1x TBS+0.05%Tween-20试剂 1000ml 用量Tween-20 0.5ml1x TBS 1000ml3 Blocking buffer：1x TBST+5% Dry Milk试剂 100ml 用量Dry Milk 5 g1x TBST 100ml（二） 、免疫反应程序：1. 取膜（平头镊子，玻璃平皿） ，放入 10ml Blocking buffer（
9、封闭缓冲液） ，室温轻摇 2h，或 4过夜。2. 一抗孵育，用 TBST 配制，1:1000（比例须看说明书，装入塑封袋中赶净气泡后用封口机封口） ，室温摇床上孵育 1h 后 4过夜。用 TBST 室温洗膜 10min3 次3. 二抗孵育。用 Tbst 稀释，1:2000（比例须看说明书，方法同上） ，室温轻摇 45min-2h。4. 用 TBST 洗膜 10min3 次。五、显影：1 试剂（1） 超敏发光液（ECL） （A、B 液等比混合）（2） 显影液：显影粉（按说明书配制）（3） 定影液：定影粉（按说明书配制）2 显影程序（1） 发光液工作液的配制：等体积混合适量 A 液（200ul）和
10、 B 液(200ul)，视膜大小而定，直接在保鲜膜上混合。（2） 显色反应：将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体（切勿接触膜的蛋白面） ，然后置于保鲜膜上，浸入并与发光液均匀充分地接触。（3） 压片检测：将膜固定于暗盒内（蛋白面朝胶片） 。暗盒内放入胶片，压片曝光。 （压片时间要摸索，15s-过夜）（4） 显影：胶片放入显影液，观察显影情况。 （时间视显影情况而定）（5） 定影：胶片放入定影液，2-10min。流水冲洗，干燥保存六、ECL 膜再生1 试剂膜再生液：（500ml）SDS：10g ； Tris：3.62g （Tris 碱） ；H2O：400ml 调 PH 值 6.7；定容至 500m
11、l；加 250l-巯基乙醇。2 膜再生程序：（1） TBST 洗膜 10min3 次（2） 用时将膜浸在膜再生液中，60水浴 30 min（摇床）（3） TBST 洗膜 10min3 次 （4） 封闭液封闭BBB 法脊髓损伤的行为学评分 评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。将动物放置于平台上,观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分三部分第一部分为 0 一 7 分,评判动物后肢各关节活动第二部分为 8 一 13 分,评判后肢的步态及协调功能第三部分为 14 一 21 分,评判运动中爪的精细动作,三项满分为 21 分.定义：将动物放入一开口盆中，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运
12、动及其协调情况。0 无可观察到的后肢运动1 1 或 2 个后肢关节轻度活动，一般为髋关节/膝关节。2 1 个后肢关节大幅运动和另一关节轻度活动3 2 个后肢关节大幅运动4 所有 3 个后肢关节轻度活动5 2 个后肢关节轻度运动和第 3 个关节大幅运动6 2 个后肢关节大幅运动，第 3 个关节轻度活动7 所有 3 个后肢关节大幅运动8 不负重摆动，或足底着地，但不负重9 仅站立的时候足底负重或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行10 偶见负重步行，但前、后肢不协调11 由频繁到持续负重步行，但无前、后肢协调12 由频繁到持续负重步行，偶见前、后肢协调13 由频繁到持续负重步行，频繁前、后肢协调14 持续协调足底步行，优势爪在刚触地和抬起时旋转15 频繁足底步行，持续前、后肢协调，偶尔足背侧步行16 持续协调足底步态，当前肢向前时无或偶有伸趾，优势爪刚触地时平行17 持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪触地时平行，抬起时旋转18 持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行19 持续协调足底步态，持续伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行20 基本内容同 18，尾在部分或全部观察期中下垂21 基本内容同 18，尾持续上翘，但躯体不稳
