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1、第五章 多肽导向技术及其应用生物技术的快速发展大大促进了新药发现与设计的速度,但是体内用药时,如何使药物特异性地到达病灶部位仍然是限制许多药物由实验室走向临床的一大难题。药物在其它组织或器官的非特异性分布,不仅增大了体内用药的剂量,使得药物成本提高;而且有可能损伤正常的组织或器官,引发毒副作用,这种毒副作用有时甚至是致死的 1。为了克服这一难题,人们提出了导向性的治疗策略,该策略的理论基础是相对于正常的组织,病灶部位(特别是肿瘤)具有自己独特的表面分子 2,这些分子不仅是相对特异的,而且常常是高表达的,所以若给药物连接上这些分子的配体或抗体,则借助于这些配体或抗体和它们相应的分子的结合,药物便
2、可特异性的被带到病灶部位。该策略被认为是提高药物特异性的有效方法,目前导向性药物的开发在药物开发领域发展处于邻先地位,仅以美国为例,其导向性药物的开发以13.2%的年增长率位居全美药物市场的首位 3。一、多肽导向技术的概念和由来导向性的分子有很多类,如抗体、靶分子的天然配体、肽等,其中以小分子肽作为导向分子的技术被称为多肽导向技术。最初作为导向性分子的为抗体,如抗转铁蛋白受体的抗体,抗HER2抗体等与药物连接后都大大提高了药物在病灶组织的富集 4,5。但是抗体由于分子量大在作为导向性分子时有一些缺点,如易引发机体的免疫反应,渗透性差等,由此人们更倾向于利用小分子肽作为导向性分子。可以作为导向性
3、分子的肽包括两大类,一类是天然存在的肽,如生长激素释放抑制因子(somatostatin) 、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)等,它们分别在神经内分泌肿瘤、消化道癌等的特异性诊断和治疗方面发挥了良好的导向性作用 6-7。另一类则是非天然存在的肽,与天然肽相比,该类肽的种类更多,鉴定更方便,而且有可能比天然肽与其相应受体的亲和力更高,故该类肽成为近年来人们关注的热点。噬菌体呈现技术则被认为是用于筛选该类肽的快速而有效的方法 8。本文将着重对以噬菌体呈现肽库来源的肽为导向分子的导向技术进行论述。二、肽库的构建噬菌体呈现技术起源于 Smith 在
4、1985 年报道的将外源多肽在单链噬菌体表面呈现的结果 9,其原理是将编码外源多肽或蛋白的基因片断插入噬菌体衣壳蛋白的基因中,从而将外源多肽或蛋白呈现于噬菌体表面 10。由于构成外源基因片段的脱氧核苷酸可以随机的排列组合,所以可以构建呈现不同外源多肽或蛋白的噬菌体表面呈现多肽或蛋白库,进而应用于酶底物的筛选,抗体的筛选,配体的筛选,蛋白间相互作用的研究,疾病的诊断等方面。近几年来,该技术迅速发展,已成为生物学研究和应用领域中有效而重要的工具。(一)用于噬菌体呈现技术的载体可用于噬菌体表面呈现的载体很多,如T4噬菌体、噬菌体及丝状噬菌体等。与丝状噬菌体相比,T4噬菌体和噬菌体作为呈现载体有一些优
5、点:第一两者均为烈性噬菌体,它们通过裂解宿主菌的方式得以释放,这样一些难以穿过细菌细胞膜的蛋白,如球状蛋白、疏水性的肽和蛋白等就可以呈现在噬菌体表面;而对于丝状噬菌体而言,其衣壳蛋白的组装是在细菌的质周腔中完成的,从而限定了其所呈现的肽和蛋白必须是能够穿越细菌细胞膜到达质周腔的。第二,T4噬菌体和噬菌体可以用于呈现高拷贝的外源分子,而且对外源分子的大小限制较小。第三,T4噬菌体和噬菌体可以比较方便的用于外源蛋白的C-端呈现。目前T4噬菌体和噬菌体呈现系统发展很快,但是丝状噬菌体呈现系统依然是构建肽库的首选载体,这是因为首先由于T4噬菌体和噬菌体呈现的蛋白是在细菌的细胞内完成的,而细胞内还原性的
6、环境无法形成二硫键,呈现的外源蛋白全部是缺少二硫键的,这样就提高了蛋白错误折叠的可能。而如前所述,丝状噬菌体呈现外源蛋白的组装是在质周腔中完成的,质周腔中氧化性的环境为二硫键的形成提供了条件,从而保证了外源蛋白折叠的准确性。第二,T4噬菌体和噬菌体的基因组大,比较复杂,操作比较麻烦,而丝状噬菌体的基因组较小,操作起来很方便。第三,T4噬菌体和噬菌体呈现系统必须进行DNA的亚克隆才能在蛋白水平上进行分析。正是由于这些原因,丝状噬菌体呈现系统仍然是目前最常用,发展最快的呈现系统。(二)丝状噬菌体呈现系统的特点丝状噬菌体是一类具有丝杆状形态的噬菌体,在分类中属于丝杆噬菌体科(Inoviride),丝
7、状噬菌体属(Inovirus)。用于表面呈现的噬菌体为一类特异性感染大肠杆菌的噬菌体,包括M13、fd、f1、If1 和 Ike 等。它们具有相似的结构。以 M13 噬菌体为例,它的核心为 6000bp 的环状单链 DNA,含 10 个基因,分别编码 10 种不同的蛋白。其中基因 VIII 编码主要衣壳蛋白 pVIII, 基因 III,VI,VII,IX 分别编码次要衣壳蛋白pIII、pVI、pVII、pIX。M13 噬菌体以其次要衣壳蛋白 pIII 仅感染具 F 纤毛的大肠杆菌 11。丝状噬菌体自身有许多适于构建多肽库的特点。如它能够接受在衣壳蛋白中插入外源多肽,并将外源蛋白表达后呈现于病毒
8、颗粒表面,便于被相应的受体或抗体识别。即使外源序列干扰病毒的生活周期,也能通过双基因或噬菌粒系统将多肽表达于表面,产生携带野生型和重组衣壳蛋白的嵌合噬菌体。易于扩增,重组后的噬菌体能够通过感染大肠杆菌得到扩增。对于筛选到的能够特异性结合某一靶分子的多肽噬菌体也能够再感染大肠杆菌,扩增后测序分析其核苷酸序列。噬菌体在各种洗脱条件(如低 pH)下仍然很稳定,可以感染形成很高的滴度(一般达到 1012) ,这样高的滴度足以代表库中所有的克隆 12。(三)丝状噬菌体呈现系统的呈现方式常用于丝状噬菌体表面呈现的是衣壳蛋白 pIII 或 pVIII。pIII是衣壳蛋白中最大的蛋白,位于噬菌体的最尾端,其
9、C 末端锚定在内膜上,N 末端游离在外。它识别并结合大肠杆菌的 F 纤毛,其用于呈现时最大的特点是对外源蛋白或多肽的大小无严格限制,大至50kD 的蛋白已被成功呈现 13-14。由于 pIII 的拷倍数只有 3-5 个,可筛选高亲和力的抗原决定簇,故常为呈现的首选蛋白,但在免疫学和生物疫苗的研究中受到限制。用 pVIII 呈现的外源分子在无任何佐剂的情况下就能刺激生物体产生较强的免疫学反应,且其拷贝数多达 2700 个左右,因此可用于筛选亲和力较低的抗体,但小分子量的 pVIII 不能容纳多于 6 个氨基酸的外源多肽,这一点限制了外源多肽与 pVIII 的融合 15。高拷贝 pVIII 在疫苗
10、开发中具有潜在的应用价值。最初人们只是简单的将外源蛋白的编码基因插入噬菌体的衣壳蛋白中,这样所有的 pIII 或 pVIII 均为非野生型的蛋白,这种呈现方式被称为 3 型和 8 型(图 1) 。但是由于衣壳蛋白对噬菌体正常生理功能的发挥很重要,特别是 pIII 蛋白对噬菌体识别并结合宿主菌密切相关,如果 pIII 或 pVIII 全部用于呈现外源蛋白,则必然影响噬菌体的生理功能,为了克服这一缺点,人们又设计了 33型、88 型、3+3 型和 8+8 型这几种呈现方式(图 1) 。33 型和 88 型是指噬菌体的基因组中含有两种衣壳蛋白的基因,一种编码野生型的衣壳蛋白,一种则编码呈现了外源蛋白
11、的衣壳蛋白。如果噬菌体的基因组中仅含编码野生型的衣壳蛋白的基因,而用噬菌粒携带编码呈现了外源蛋白的衣壳蛋白的基因,则这种呈现方式称为 3+3 型或 8+8 型。33 型、88 型、3+3 型和 8+8 型的噬菌体的衣壳蛋白中及含有野生型的蛋白壳,又含有呈现了外源蛋白的衣壳蛋白,这样即呈现了外源蛋白,同时又保持了噬菌体的天然功能 16。在呈现外源分子时,人们常用 N 末端呈现法,但这并不意味着C 末端呈现不重要。恰恰相反,在有些情况下必须用到 C 末端呈现,例如研究那些需要游离 C 末端的蛋白与蛋白间的相互作用。除此之外,C 末端呈现对于呈现细胞内蛋白也很重要,噬菌体组装前,pIII 和 pVI
12、II 以它们的 C 末端滞留在大肠杆菌的内膜上,它们的 N末端则在质周腔内 17。有些分泌性的蛋白需要在氧化性的环境中才能很好的折叠,质周腔的环境正好提供这一条件。但对于那些需要在还原性的环境中才能很好折叠的蛋白,则必须用 C 末端呈现使外源蛋白位于还原性的胞内环境才能满足其要求 18。图 1. M13 呈现系统的呈现方式三、导向肽的筛选筛选是指用一些方法从噬菌体文库中挑选出呈现了人们所需要的肽的噬菌体克隆。一般情况下,第一轮筛选要投入一个库容较大的库,通过感染宿主菌,阳性噬菌体得到扩增,然后进入下一轮筛选,从而使阳性噬菌体得到进一步富集。严谨性和产率(stingency 和 yield)是两
13、个评定筛选效率的主要参数。一般而言增加前者往往会导致后者的降低 19。目前常用的筛选方法可分为两类,一类是体内筛选,一类是体内筛选。(一) 体外筛选当纯化的靶蛋白易于获得或高表达靶蛋白的细胞易于获得时,人们常常选用体外筛选法来对噬菌体文库进行筛选。该方法的基本流程为首先将筛选配基固定在固相载体上,然后加入噬菌体文库。其中呈现了与配基结合肽的噬菌体被捕获于固相载体上,而不与配基结合的噬菌体则被洗去。再用洗脱液洗脱结合的噬菌体并感染大肠杆菌得以扩增,扩增后的噬菌体进入下一轮循环。亲和配基的固定可采用许多种固相支持物,如表面吸附的聚丙乙烯皿或管,硝酸纤维膜和磁性珠,可渗透的珠状琼脂糖凝胶等。洗脱的方
14、法也有多种,常用的有低 pH 的缓冲液洗脱法和用配基的已知配体与噬菌体竞争的竞争洗脱法。以下列举了一些体外筛选法获得的多肽(表一)。表一 体外筛选获得的异性结合肽靶分子/ 结合的肽 生物学评价 参考文靶细胞 献人转铁蛋白受体(human transferrin receptor,hTfR)HAIYPRH,THRPPMWSPVWP高亲和力(亲和力达 1.5x10-8M)地与高表达 hTfR 的细胞结合,并且可以介导大分子的内化。20v1整合素VSWFSHRYSPYSPFAVS可以与 v1 整合素结合 21黑皮质素受体 1 (melannocortin receptor 1,MCR1)FRW 体外
15、实验中,与 MCR1 高表达的细胞特异性结合的能力是表达其它 MCR 细胞的 3000 倍,并且可以竞争抑制 MCR 的天然配体 促黑激素(-melanocyte-stimulating hormone,-MSH)与 MCR1 的结合22 血管内皮细胞生长HTMYYHHYQHHL高亲和力的和 VEGFR结合,可抑制鸡胚脲囊膜的血管生成,在肿瘤动物模型中抑制乳腺癌的生长23 、 因子受体(vascular endothelia cell growth factor receptor, VEGFR)NGYEIEWYSWVTHGMY肽分别与半乳糖甘酶和过氧化酶连接后,融合蛋白与 VEGFR结合的亲和
16、力分别比单纯的半乳糖甘酶和过氧化酶与 VEGFR结合的亲和力提高了 200 倍和400 倍24白介素11 受体(interleukin 11 receptor, IL 11 R)CGRRAGGSC 有效的识别 IL 11 R,有望用于前列腺癌的诊断和治疗25鼻咽癌细胞RLLDTNRPLLPY 与包裹了阿霉素的脂质体相连后,体外实验中该脂质体特异性杀伤鼻咽癌细胞,体内实验,可是用药量减低至原来的 1/526 人脐静脉细胞SIGYPLP 当与腺病毒相连时,其基因转染效率比单一的腺病毒提高了15.5 倍27神经胶质瘤细胞V L P H 与 RG2 神经胶质瘤细胞结合的活性是星形胶质细胞的 63 倍28(二) 体内筛选在有些情况下,当某些抗原及标志物不易确定或难以获得纯化产物时,体内筛选是比较合适的选择。体内筛选的优点是其是在体内进行的,所以筛选出的肽是与完全保持了