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1、蜜蜂分子生物学通用技术-PCR检测应用实例,1,蜜蜂样本的采集、标记及保存,表2-1 小蜜蜂样本采集信息表 Table 2-1 Sample collection information of A. florea,2,蜜蜂样本分布图,图2-1 西双版纳蜜蜂种类分布调查表 Fig. 2-1. Distribution of three honey bee species of Xishuangbanna County,3,主要试剂,TRIzol Reagent（Life Technologies Co.）、氯仿（Invitrogen Co.）、异丙醇（Invitrogen Co.）、70%乙醇、
2、去RNA酶水（Invitrogen Co.）。,4,制冰机、低温离心机（eppendorf centrifuge 5004R）、移液枪（Gilson，10l、20 l、100 l、200 l、1000 l量程）、无菌枪头（10l、20 l、100 l、200 l、1000 l）、漩涡混合器（Labnet VX100）、掌式离心机（ISC BioExpress）、电子天平（Mettler AE100）、超净工作台（PCR Chamber）,主要实验仪器,5,从-80冰箱中取出单个蜜蜂样本放入已标记的1.5ml离心管中，用一次性塑料研磨棒快速捣碎，在无菌工作台内加入500l细胞裂解剂（TRIzol
3、），漩涡震荡1min。室温孵育3min，充分降解样品中的核酸蛋白； 每个离心小管加入100l氯仿后盖好盖子，上下剧烈震荡50次后置于室温下孵育3分钟； 放入低温离心机内，在4下10,000rpm离心10min。样本混合液分离为下层的红色的苯酚氯仿层和无色上清水溶液。样品总RNA被溶解在上清水溶液中；,Trizol法提取蜜蜂样本总RNA实验步骤,6,将离心管内的上清水溶液移入另一个1.5ml离心管中，加入500l乙丙醇，上下倒置混匀后，室温静置10min后，4下12,000rpm离心15min。粉红色RNA析出物沉淀于离心管壁内侧； 倒掉离心管内溶液，加入70%乙醇500l，漩涡震荡20sec清
4、洗RNA沉淀物，4下9,000rmp离心5min； 倒掉管内乙醇溶液，并用高压灭菌滤纸吸去离心管内剩余乙醇； 加入100 l去RNA酶无菌水溶解RNA沉淀，立即放入-80冰箱保存。,Trizol法提取蜜蜂样本总RNA实验步骤,7,总RNA的纯度和浓度检测,纯DNA：OD260/OD2801.8 (1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0时表明可能有异硫氰酸残存）,8,表 2-3 七种蜜蜂病毒引物碱基序列 Table 2-3 Seven pairs base sequence for RT-P
5、CR,PCR反应引物设计,9,表2-4 RT-PCR反应体系配制表 Table 2-4 RT-PCR reaction systems,PCR反应体系配制,10,将配好的RT-PCR反应液放入PCR仪中进行扩增，反应程序如下： 逆转录，48,45min； 逆转录酶灭活，94,2min； 变性，94，30sec； 退火，60，60sec； 延伸，68，120sec； （3）（5）进行40个循环； 最后在68条件下，延伸7min后，结束反应， 产物保存于4冰箱中。,PCR反应程序,11,PCR反应产物凝胶电泳检测,配置1%的低熔点琼脂凝胶，准确称量1g低熔点琼脂糖粉加入到已装有100ml 1TAE
6、缓冲液的600ml锥形瓶中，放入微波炉内加热至琼脂糖粉完全溶解。 待1%的琼脂溶液冷却至60，加入5l溴化乙碇（贮存浓度为10mg/ml，最终浓度为0.5g/ml），混合均匀。 将配好的琼脂溶液倒入两端胶带封口并插入梳子的模具中，待其完全凝固后取下封口胶带，放入电泳槽内，加入1TAE缓冲液浸没琼脂凝胶，小心拔出梳子。 在每个RT-PCR反应管中加入6l DNA凝胶loading buffer并混合均匀，按以下顺序上样到琼脂凝胶孔内： No.1 100bp Marker No.2 H2O S1 S2 S3 . . No.4 H2O No.5 Negative Control No.6 Posit
7、ive Control,12,PCR反应产物凝胶电泳检测,接上电源，100V恒定电压电泳1hr，至二甲苯条带移动至琼脂胶的2/3位置，结束电 泳。 取出琼脂凝胶，放入凝胶成像仪内，显像观察并打印（图2-2）。,13,PCR反应产物回收,通过凝胶电泳分离不同长度的DNA片断，然后在紫外灯下，用无菌刀片切下目 的条带（约300mg），放入一个1.5ml离心管内，密封后置于70水浴，待其完全 融 化， 使用DNA纯化试剂盒（Promega）按操作步骤回收所需的PCR产物，将回收的DNA置于-20冰箱内保存。,分子克隆PCR片断：连接反应，转化反应，小量制备，收获质粒,14,DNA序列测定,将PCR纯化产物的质粒样本送往测序公司测序，以获得样品的核酸序列数据。,15,DNA序列的比对：登陆NBCI，进入Blast 的核酸序列数据库，比对所得序列数据。,DNA序列的比对与分析,DNA序列的分析：将定性DNA序列用分子分析软件进行数据分析，得出结论。如是新发现的基因序列可将其在“GeneBank” 数据库发表。,16,
