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1、硝酸盐、盐度和无机碳对Porphyra torta（红藻门）幼配子体生长和色素的影响关键词：紫菜，海藻，海水养殖，生态生理学，氮，盐度，无机碳，增长速度， 藻红蛋白，色素摘要Porphyra torta Krishnamurthy（红藻门）配子的绿叶阶段，是一种在阿拉斯加海水养殖的候选种类，仅在冬季和早春生长，并仅限于阿拉斯加东南部外海岸。为了帮助确定限制这个种类的季节性和地理分布的具体环境因素，利用三个物理因素的现实环境水平进行培养实验。在代表每个因素的最高和最低水平的硝酸盐、盐度和无机碳的组合下比较幼配子体的生长和藻红蛋白的含量。复苏实验同时进行，以确定是否受低硝酸盐或盐度影响的叶片能够恢
2、复正常生长速度和色素水平。为了在统计上作出有效的处理组生长率的比较，进行重复试验，测试了两阶段分析，并证实是适当的。低硝酸盐对于生长和藻红蛋白含量有重大的负面影响。盐度对于叶片生长有微弱的负面影响，然而无机碳既对叶片生长没有影响，对藻红蛋白含量也没有重要影响。受低硝酸盐影响的叶片，当增加硝酸盐含量时，在长达6个星期的处理后，能够恢复正常的生长速度，并高于正常水平。随着时间一开始增加，由数据得到的生长速率，依赖于硝酸盐水平。导言Porphyra torta是世界范围内已知的至少70种紫菜种类之一（Stiller & Waaland, 1993），是沿着东北太平洋的多岩石海滩上部潮间带区域的冬天及
3、早春的栖居者(Conway & Cole, 1977; Waaland 等, 1990; Lindstrom& Cole, 1993)。P. torta和它的春天及早夏对应物P. abbottae是阿拉斯加东南部特林吉特人的传统饮食的一部分，叫做laakusk (黑海藻) (Betts, 1991)。Porphyra是世界上最古老和最重要的养殖作物品种之一，培育品种已经被选定并且在三百年间在今天的世界领先的生产商，日本、中国和韩国，被开发。Porphyra已经在华盛顿和美国缅因州和加拿大(Byce等, 1984;Waaland等, 1986; Mumford, 1987, 1990),但是它作
4、为商业作物的潜力在北美仍然未发展(Merrill, 1993)。P. torta是几个北美西海岸种类之中，由Waaland等根据她们的商业潜力确定和Lindstrom (1993)根据在阿拉斯加的商业潜力确定。P. torta的生命周期是双相的，一个多叶，单一配子体和一个纤维状、二倍体孢子体或者丝状体(Drew, 1949; Conway & Cole,1977)。壳孢子的成熟和释放需要1个短的光周期12h或者更少(Waaland 等,1987)。这种刺激也许加上环境要求，对P. torta的叶片生长作用(Waaland et al., 1990).阿拉斯加东南部的P. torta仅限于整年盐
5、度稳定，大约在30ppt的外面海岸地区。在内水域中，盐度季节性变动，10ppt或者更少(Conitz,1999)。这项研究涉及的问题是，低盐度是否对P. torta有限制。港湾和上部潮间带藻类通常有更广泛的耐受盐度(Russell, 1987),能经常忍受盐度短期变化，没有完全渗透调节(Kirst, 1995; Reed, 1990)。无机碳的稀释能够混淆盐度对在低盐培养基中海藻光合作用的影响(Ogata & Matsui, 1965; Ogata & Schramm, 1971;Ohno, 1976)。在东南阿拉斯加沿海水域，在强的淡水稀释期间，总无机碳能从它至少2.0meq L1的典型水平
6、下降到1.5meq L1(Conitz, 1999)。这项研究也因此调查了无机碳稀释在低盐培养基中的影响。在沿海水域氮供应随季节强烈波动，与海藻季节性增长模式相联系(Lobban & Harrison, 1994)。在东南阿拉斯加水域，硝酸盐在早冬达到它的年度最高，大约在40-45M(Conitz, 1999)。冬天，P. torta的配子体阶段的出现可能是对季节性氮循环的适应。大多数可利用的溶解无机氮，主要是硝酸盐（NO3)和氨(NH4+),在阿拉斯加水域，很快被春季浮游植物大量出现而消耗，在晚春下降到1.0M以下，在整个夏天保持那种低水平。(Conitz,1999; Ziemann 等,
7、1989)。在海藻中，氮素吸收、利用和储存几个途径，能够使他们在有限的氮素环境中竞争(Lobban & Harrison, 1994),包括多余氮的积累，硝酸盐、氨基酸、蛋白质、酶或者光合色素(Hwang等, 1987; Hernndez等, 1993; Naldi & Wheeler, 1999)。光合色素已经被用来作为氮素缺乏和恢复的指标(Amano & Noda, 1987),和对于江蓠属水体氮的可及性的指标(Jones等, 1996; Horrocks等, 1995)。在这些实验中，我们假设，如果硝酸盐水平微不足道或为零，P. torta将停止生长。我们有兴趣知道硝酸盐水平略高于零是否
8、可以支持生长。硝酸盐供应对光合色素水平的关系也考虑了。最后，我们想知道P. torta叶片的氮素消耗的影响能否被逆转，以及在什么时期。Porphyra torta能够被可靠地培养通过他的生命周期，但是叶片生长和生理的具体环境因素的影响大多未知。在华盛顿州P. torta实地栽培实验中，叶片生长被测量(Waaland等, 1986)，在培养中幼叶片的生长的具体因素的作用被测定(Hannach, 1989; Hannach & Waaland, 1989)。这项研究调查了在幼P. torta叶片的生长和藻红蛋白含量对硝酸盐、盐度和无机碳原为和更低水平的依耐性。这些因素的可能的相互作用和P. tor
9、ta叶片从这些因素限制中恢复的能力，被包含在实验设计中，并特别关注。材料与方法Porphyra torta Krishnamurthy丝状体(culture PtEI02a1)是1997年4月9日从阿拉斯加Elovoi岛一个叶片的单一果孢子克隆而来(5649N，13524W)。0.025g（鲜重）自由丝状体零散培养，在8h光照：16h黑暗的光周期（8：16 L:D）,光子通量密度90-110mol m2s1 (PFD) and 12 。培养基时一个用Guillard的 f/2 丰富的人工海水基地(Guillard & Ryther,1962)。水运动由Labline 3-D 旋转器，30 rp
10、m提供。包子在一批培养31/2周后被释放在一个单脉冲，到20m网格Nitex网的基板。一星期以后首先观察萌芽及附着。在最初生长期，富集培养基硝酸盐被降低到88m（f/20），其余营养盐在f/2水平，并且每周变化。孢子释放后4周，叶片附着的各自基质片段，被放在包含10mL培养基的单独的25mL锥形烧杯中，在一个实验性处理的12组合盐度、碳酸氢盐和硝酸盐，有4个重复。通过用蒸馏水或包含2.0mm NaHCO3的蒸馏水稀释AW基地，得到三个盐度水平（30，15，7.5ppt）。因此，在每个盐度水平内，碳酸氢盐要么根据盐度稀释，要么增加到保持2.0mm浓度。每隔人工海水基地混合物的一部分硝酸盐被丰富了
11、在88m，另一部分在2.2m；其余营养物质与f/2一样。每个因素的最高水平接近环境因素的最大水平，被指定为“正常”或对照水平。（注意，两个在30ppt盐度水平的碳酸氢盐水平实际上相同的，但为了保持一种平衡因子设计，被视为单独水平。）培养是在和孢子释放期间同样的对照环境条件下生长，在上面列出，随每周培养基变化。基线测量是在同一天，但是在实验性处理之前，这个数据被指定为week0。每周一次和以下6个星期（wks 06),随机选择没培养瓶三个叶片，用来测量和藻红蛋白（PE）分析。用Optimas 4.0 图像分析软件，从叶片的录像显微镜图像，数据测量叶片表面面积。然后为了分析藻红蛋白，叶片被冷冻在0
12、.2m NaCl 和pH 6.7的 0.2 m H2PO4/HPO42缓冲液。每个来自两个重复培养的三个叶片样品相互结合治疗，以给于足够的材料可供提取。外表皮和细胞壁要求在藻红蛋白水提取前酶切。13单位每mL提纯的木瓜蛋白酶（Sigma）,用来消化表皮。鲍消化酶(Sigma，鲍鱼丙酮粉，原油)的一种过滤灭菌的提取物(H2PO4/ HPO42缓冲液），在最终浓度1.0 mg mL1，pH6.7,增加以被细胞壁消化（PolneFuller & Gibor, 1990)。在磷酸盐缓冲液的一个冻结-融化循环，细胞壁消化以后，藻红蛋白被提取，通过玻璃纤维过滤器被过滤(Advantec MFS)。这种方法
13、被测试对对照标准，在实验样本提取之前记录光谱，以确保藻红蛋白光谱不会定性受酶切影响。对照在H2PO4/ HPO42 缓冲液的一个空白包含1.0 mg mL1鲍酶提取物，在700、588、565和455 nm读出藻红蛋白提取物的吸光度。最终藻红蛋白浓度使用公式计算，藻红蛋白= (A565 A588) ( A455- A588)0.200.12 ，并且以干重标准化。(Beer & Eshel, 1985)为了测试从任何实验处理的影响的复苏，在2、4和6周，一个子叶片被搬离每个培养瓶，并且运行在正常培养基生长10天。每个瓶的叶片随机取样测量，如上所述，在复苏期的开始和结束时期，分析藻红蛋白含量。生长
14、实验的数据用量阶段或衍生变量分析来分析(Diggle等, 1994: pp. 154)。用试探性数据分析方法(Hoaglin等, 1983; Cleveland, 1993)，叶片表面数据的-5次方跟（-0.2次方）转化，发现每个处理的面积和时间呈线性关系。在分析的第一阶段，利用转化的表面积对时间和复制品的稳健回归，得到每个处理的倾斜系数（n=4）(S-Plus 4, 1997)。在第二阶段，硝酸盐、盐度、碳X盐度的联合作用的主要影响的稳健回归系数，用方差分析研究。（Neter等, 1996）。合适尺寸被转换为原始尺寸大小，从模型的区别得到瞬时增长率。利用每周数据，方差分析硝酸盐、盐度、碳X盐
15、度的主要影响以及硝酸盐和盐度对藻红蛋白浓度的联合作用。对于复苏数据，在10 天复苏期结束到实验处理的最后一天期间，利用方差分析叶片表面积（生长复苏）和藻红蛋白含量(藻红蛋白复苏)的不同。使用诊断和探索型数据分析方法检测假设方差分析模型的每个数据(Hoaglin等, 1983; Cleveland, 1993; S-Plus 4,1997)。结果叶片生长 (图1) 6周，盐度、无机碳和硝酸盐12个实验性处理组合下的幼P. torta叶片的生长。盐度水平是30、15、7.5ppt(1x、0.5x、0.25x正常环境水平)。盐度内嵌套的一个因素无机碳，要么像碳酸氢盐一样被增加到2.0mm,或者稀释到
16、同盐度一样的水平。高硝酸盐是88m，低硝酸盐是2.2m，（大约分别是2X最大值和略高于极小的环境水平）。每周测量叶片表面积，n=4。用黄色光滑曲线表明生长趋势。The P. torta叶片在所有处理中经过6周实验期生长，但生长根据处理变化(图1)。F-tests的健壮回归系数对硝酸盐有意义，p=0.021。在低硝酸盐组中所有盐度水平和碳X盐度水平的生长率降低。生长率也随着盐度而下降，但差异微弱，p=0.079。t时叶片大小的模型是：y，=0i + (. + i ) t + , i = 1,.,m，其中y，是叶片面积的-0.2次方的转化，0i是i组初始面积的-0.2次方转化，.是所有组的总平均值，i是在i水平硝酸盐的解释性变量，是误差项。其余可能的解释变量，盐度和碳，不包含在内，因为它们不显著，p 0.05。叶片面积由方程预测，面积area=( y)5。t时瞬时增长率由方程预测，生长率=d(面
