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1、1,南京林业大学,2,对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。,3,为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。,4,目的基因： 已知基因： 未知基因：构建基因
2、文库 特定探针的制备 文库的筛选（筛库） 含目的基因的克隆,5,南京林业大学,6,南京林业大学,7,南京林业大学,8,南京林业大学,9,基因文库的好坏要看该文库是否覆盖起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作丧失其中的基因或某些序列。 构建基因文库时，一个最重要的指标就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆盖所有原初序列(代表性文库)?如果某些序列如缺少限制性酶切位点的重复序列未被克隆，这样的文库就不具代表。 同样如果文库中未能含有足量的克隆，则极有可能会丢失某些基因。富含某种序列的cDNA文库显然会缺少其他一些基因，但若正确制备并扩增，也可以成为富含mRNA起始材料的具代表性的文库。,具
3、有代表性的基因组文库,10,南京林业大学,只有当此文库中重组子总数达到某一值时，才能包含基因组中所有基因，才可称之为完整基因组文库。所需重组子数目主要取决于基因组的大小和目的基因片段的大小。 1975 年，Clarke 和Carbon 提出了一个计算这一重组子数目的公式。,11,N=ln(1-P)/ln(1-f),N 为所需的重组子的数目； f 为单个重组体中插入片段平均大小与基因组DNA 总量之比； P 为选出某一基因的概率(通常期望为99%)。,12,南京林业大学,13,14,15,16,南京林业大学,17,I1-4载体,对于某一特定的基因组，构成其DNA 文库所需的重组子的数目，在很大程
4、度上与构建文库所用的载体的容量紧密相关。,质粒、噬菌体、粘粒、BAC或酵母人工染色体等载体都可被用来构建基因组文库，选用哪种载体取决于基因组的大小。这些载体所能插入的片段大小的上限分别依次为10kb、23kb、45kb、350kb和1000kb用T4DNA连接酶将基因组DNA片段与制备好的载体分子相连接。,18,附：原核生物基因组DNA文库的构建,（一）原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA 要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂,19,（二）基因组DNA的不完全酶切,1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率
5、: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因族： 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量,20,（三）酶切片段与克隆载体连接,、酶切片段的分离与纯化 ）低熔点琼脂糖回收目的片段 ）试剂盒回收目的片段,21,2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择,a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为10kb) b）载体可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载45k
6、b DNA左右片段(有效的范围为40 kb),22,（四）重组转化受体细胞,、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷 型的抑制型菌株，可与pUC编码的半乳糖苷酶氨 基端实现互补。 HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高 JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌 JM109: 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌 MZ-1: 温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体启动子 质粒载体的宿主菌,23,、重组质粒转化受体细胞,1）转化法(transformation) 2）转导法(transduction
7、) 3）转染法(transfection),24,（五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选,1、基因组DNA文库的保存 1) 影印膜滤保存法,25,2）文库在液体培养基中扩增保存,方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为25%的甘油）。 缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致 文库中某些特定的序列过多或过少。,26,3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中,方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为25% 的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。
8、缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大,27,南京林业大学,28,通常不用原核mRNA来构建cDNA文库，因为原核mRNA通常不稳定；相比之下则较易制备基因组文库，且可包含所有基因组序列。 从真核mRNA构建cDNA是非常有用的，因为cDNA不含内含子序列，可被用来在大肠杆菌中表达编码蛋白。,真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都只有15%左右的
9、基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。,cDNA文库,29,cDNA基因文库构建的步骤,细胞总RNA的提取和mRNA的分离 第一条cDNA合成 第二条cDNA合成 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖,30,cDNA文库的构建：,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,31,32,33,南京林业大学,34,南京林业大学,mRNA完整性的检测 1)mRNA分子的大小： 哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间. 2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的
10、能力,35,mRNA在细胞中的丰度,1) 高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA 。 2) 低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。,mRNANA,RNA,36,南京林业大学,37,南京林业大学,38,第一链cDNA的合成,oligo(dT)引导的DNA合成法： 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。,39,引导合成法：获得的双链cDNA 能保
11、留完整的5端序列,第二链cDNA的合成,末端转移酶,DNA聚合酶I缺失5至3外切酶活性的截短部分,40,南京林业大学,双链cDNA末端的形成及其接头添加,41,基因组DNA文库,cDNA文库,附：基因组DNA文库与cDNA文库的比较,42,1 基因组DNA文库的优点,相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组D
12、NA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。,43,2 cDNA文库的主要优点,cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 cDNA文库的筛选比较简单易行。 每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。,44,3 cDNA克隆的主要的缺点,cDNA文库所包含的遗传
13、信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。 cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。 在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。,45,46,南京林业大学,47,48,克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分
14、洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。,49,南京林业大学,50,南京林业大学,51,南京林业大学,52,南京林业大学,53,南京林业大学,54,放射性抗体检测法,滤膜（固定抗体）,+,55,扣除文库(subtractive library),扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。 差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆的分离则有相
15、当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实可行的办法是构建富含目的基因序列的cDNA文库。应用扣除杂交筛选法便可达到此种目的。,56,扣除杂交（Subtractive Hybridization）,57,Hybrid arrest (杂交扣留),Hybrid arrested translation: cDNAhybridized mRNA proteins Hybridization: Individual cDNA clones or pools (群) of clones can be hybridized to mRNA preparations. The hybridize
16、d mRNA can not be translated to proteins, and the detection of proteins can be used to find which cDNA can arrest which protein. Subdivision (细分): of the pools of cDNA into smaller numbers and repeating the experiment should allow the identification of a single cDNA that arrests (扣留) the translation of one protein.,应用细胞外翻译系统,58,Hybrid release (杂交释放),Hybrid release t
