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1、浅析乳制品中高危害食源性致病菌-阪崎肠杆菌的快速检测彭年才（西安交通大学生命科学与技术学院，生物医学分析技术及仪器研究所中国陕西.西安 710049 ） 摘 要：2006 年国家出台的婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则中明确要求采用国际通行的“荧光 PCR 仪 ”作为出厂检验必备设备，此要求已成为乳品企业生产许可证核发的必要条件。本文简单综述了国际通行的保证食品安全的食源菌检测标准、仪器和方法。介绍了乳制品高危致病菌阪崎肠杆菌的危害、检测必要性以及检测方法的历史演变。在介绍荧光 PCR 技术特征的同时，重点论述了荧光 PCR 方法检测乳品中阪崎肠杆菌的政策要求、技术标准、实验技术、检测步骤以及实
2、验室建设要点。本文以具有自主知识产权的国产荧光 PCR 仪及试剂为例，具体介绍了阪崎肠杆菌检测过程和筛选判别实例。关 键 词：食品安全、食源菌、乳品检测、阪崎肠杆菌、荧光 PCR 仪、快速检测世界贸易的全球化同时也带来了食品安全风险！食品安全是全球日益关注的一个重要的公共卫生问题。全球每年发生食源性疾病数十亿例，发达国家发生食源性疾病的概率也相当高，平均每年 1/3 的人群感染食源性疾病。 近年来，世界范围内屡屡发生大规模食品安全事件，如：日本上万人葡萄球菌肠毒素导致的雪印牛奶中毒、英国的疯牛病、法国的李斯特氏病毒、泰国的禽流感、比利时的二恶英事件等。每年由数十亿例食源性疾病而导致的医疗费增加
3、、不安全食品的召回、以及产品的销毁带来的经济损失不可估量！食品安全引起的“食物恐怖”：以食源菌或化学性、生物性、放射性等有害物质污染甚至蓄意污染食品，导致人群伤害或死亡，破坏社会经济或政局稳定的行动或危险越来越被人们所重视，如大头娃娃和毒饺子事件，无一不给我们敲响警钟。其中食源菌污染是导致以上事件的主要原因，因此制定食源菌检测标准、采用国际通行的检测仪器以及研制和使用具有自主知识产权的国际通行检测仪器是被学界、政府、企业界和人民群众公认为目前的当务之急。本文就乳制品中高危害致病菌阪崎肠杆菌的检测做一些简要的分析。1.阪崎肠杆菌的危害及检测的必要性阪崎肠杆菌是奶粉(乳)制品中新发现的一种致病菌，
4、可以引发婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发。研究报告表明婴幼儿配方奶粉是主要感染渠道,由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达 4080%，已引起世界多国的重视。阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视。据报道,国外乳业巨头曾因此被召回.在美国 FDA2002 年在本土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌后，2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉，阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点。但是几年前国内企业鲜有自查能力,原因是国内以前还没有专门的检测手段,而去买一套以前国内从未有过的检测设备也不是马上就可办到的。
5、目前,国外奶粉(乳) 制品巨头就以拥有先进检测手段作为一个有力的宣传点,比如惠氏（中国）宣称保证在中国销售的每一个产品都经过了阪崎肠杆菌的检测才上市；同样宣称拥有此检测设备的企业还有美赞臣（中国）公司。在国外发现的奶粉中的阪崎肠杆菌并非有其特定的区域局限性，中国奶粉企业又面临一项大难题。值得庆幸的是：2005 年 5 月 20 日，由中国检验检疫科学研究院和天津出入境检验检疫局牵头完成的奶粉中阪崎肠杆菌检测方法行业标准在京通过了审定。这项标准的出台，解决了我国检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌无标准、无检测方法的问题。同年 10 月该标准被实施。与之配套 2006 年出台了 06 版乳品企业生产许
6、可证关于印发食用植物油等 26 个食品生产许可证审查细则的通知 ，其中附件 8：婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则(2006 版)里明确规定采用国际通行的“ 荧光 PCR 仪”为出厂检验必备设备。另外多部国家标准明确要求用 PCR 方法检测阪崎肠杆菌、食品中致病菌等。如中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1632.12005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第 1 部分：分离与计数方法；第 2 部分：PCR 方法；第 3 部分：荧光 PCR 方法；SNT 1204-2003 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光 PCR 定性检验方法；SNT 1635-2005 贝类中诺沃克病毒检测方法 普通
7、 RT-PCR 方法和实时荧光 RT-PCR方法等实时荧光定量 PCR 技术正是采用国际通行的检测标准，进行阪崎肠杆菌的检测。除应用于乳品企业外，还大量应用于食品加工企业、医疗机构等。为了打破国外先进食源菌分子检测仪器在我国的垄断地位，同时降低食品加工企业拥有该类仪器的门槛，近年来我国政府十分重视扶持具有自主知识产权的实时荧光定量 PCR仪器的开发和推广工作。据中国乳品工业2007 年总第 198 期，国产实时荧光定量 PCR仪已通过性能检测、 ，临床试验，获得了医疗器械注册证。在多家乳品生产、食品加工、医疗机构推广应用，效果良好。性能达到国际同类产品先进水平。2.阪崎肠杆菌的检测方法常用病原
8、菌检测品种：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森式菌、单增李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌等。包括阪崎肠杆菌。检测方法的历史演变：通常检测食物病原体有多种方法，如 18 世纪初，仅仅是通过常规尿液和血液成分检测肝病、肾病；18 世纪中，体液酶的分析通过碱性磷酸酶检测肝功能；血清淀粉酶检测胰腺炎；酶类标志物检测心脏病；19 世纪，放射及酶联免疫分析激素检测内分泌功能；肿瘤标志物检测癌症；蛋白标志物检测心脏病；到了 20 世纪，生化检测血糖等糖尿病、心血管；生理参数心血管病等；21 世纪，应用分子生物学，通过实时定量 PCR 分子诊断仪实现基因诊断：食品安全、病原体及传染、肿瘤、遗传病等各
9、种检测方法从灵敏度、特异性、抗污染、易操作性四方面比较表明，PCR 检测方法具有灵敏度高、特异性强、抗污染能力强荧光 PCR 、容易操作等特点。PCR 检测方法又分为三种：荧光法、电泳法、ELISA 法。分析对比图见下表： 荧 光 法 电 泳 法 ELISA法 灵 敏 度 102copies/ml 104copies/ml 103copies/ml 特 异 性 强 差 ， 无 法 区 分 非 特异 产 物 强 抗 污 染 强 ， 避 免 假 阳 性 差 ， 易 产 生 假 阳 性 差 ， 易 产 生 假 阳 性 易 操 作 性 易 易 操 作 复 杂 定 性 可 可 可 定 量 定 量 范 围
10、 10-10 不 能 定 量 定 量 范 围 104-6 3.荧光 PCR 方法简述PCR 历史发展的三个阶段：定性 PCR（电泳法） 、酶免法 定量 PCR、实时荧光定量PCR。实时荧光定量 PCR 技术比定性 PCR 技术发明晚将近十年，相比定性 PCR，它有如下突出优点：荧光定量 PCR 反应过程实时监测、荧光定量重复性好、基因定量分析稳定性好、荧光检测浓度梯度试验线性范围宽、热循环升降温快速、荧光定量在对数期进行定量分析等优势。西安天隆 TL988 荧光定量 PCR 仪曲线4.荧光 PCR 实验室建设要点由于 PCR 技术特别灵敏，为防止试验过程交叉污染，应根据临床基因扩增检验实验室管
11、理暂行办法卫医发200210 号和临床基因扩增检验实验室工作规范 卫检字20028号相关要求，对 PCR 实验室进行防污染布局和管理。PCR 实验室原则上应分为四个隔开的工作区域，每一区域都应有专用的仪器设备，分别是 1 试剂储存和准备区、2 标本制备区、3 扩增反应混合物配制和扩增区、4 扩增产物分析区。根据管理办法规定，如果使用实时荧光定量 pcr 仪，各区域可适当合并，我们建议将扩增区和产物分析区合并为扩增检测区即共三个间。5.阪崎肠杆菌荧光 PCR 检测步骤 （以西安天隆科技有限公司生产的 TL988 型实时荧光定量 PCR 仪及阪崎肠杆菌检测荧光试剂为例）标本取样 取样前消毒样品包装
12、的开启处和取样工具。按照“三管”增菌法，无菌称取100g，10g 和 1g 样品各三份分别加入 2L，250ml，125ml 的样品稀释瓶中，加入 9 倍预热到 45的灭菌水1：10 稀释，或者将样品直接称量到装有 9 倍预热的 45的灭菌水的样品稀释瓶中，振荡使样品充分混匀，361培养 1822h。分别移取培养 1822h 的悬液各 10ml 加入 90ml 肠杆菌增菌肉汤EE 肉汤中，361培养 1822h。检测步骤试剂制备取出反应管 N 支（N样本数1 管阳性对照1 管阴性对照） ，瞬时离心后，存于 4备用。DNA 提取标本处理：每瓶培养的 EE 肉汤分别取 1ml 加到 1.5ml 无
13、菌离心管中，8000r/min 离心5min，尽量吸弃上清液；加入 50ulDNA 提取液使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取，混匀后沸水浴 10min,12000r/min 离心 5min,取上清液 2ul 做模板进行 PCR 反应。PCR 扩增-加样 取出备用的 PCR 反应管，分别加入处理后的样品上清 2ul，阴阳性对照直接加2ul，瞬时离心后放入仪器样品槽进行 PCR 反应。 -编辑 21 点击新建文件，输入实验文件名称 22 对应样品槽样本放置顺序设置阴、阳性对照以及未知标本，并在 Name 拦中设置样品名称。 23 换到温度设置窗口设置循环条件：如下步骤 温度 时间 循环数1 94
14、5min 194 20sec260 50sec 1094 15sec360 40sec30步骤 3 中 60时读取荧光值。编辑完成后点击开始运行，出现热盖温度是否等待，请点击是。试验有效性判定 设定阈值线高于阴性对照最高点，阳性对照的 Ct 值25，反应有效。结果判定 设定阈值线高于阴性对照最高点， 检验样本 Ct 值小于或等于 25.0 时，报告阪崎肠杆菌筛选阳性；检验样本 Ct 值大于 25.0 且小于 30.0 时，重复一次，如果 Ct 值仍小于 30.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告阪崎肠杆菌筛选阳性，否则报告阪崎肠杆菌未检出；样本检验不到 Ct 值时，或 Ct 值为 0 时，报告阪崎肠杆菌未检出。作者简介彭年才：男，高级工程师，国家 863 计划评审专家，863 计划重点项目“重大疾病检测与预警微系统”首席专家，西安生命科学与技术协会秘书长。研究方向：病原菌快速检测、生命科学仪器。
