《Western_Blotting免疫印迹(试剂配制--每步操作详解--WB常见问题分析--分离范围)[汇编]》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Western_Blotting免疫印迹(试剂配制--每步操作详解--WB常见问题分析--分离范围)[汇编]（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Western（试剂配制和操作步骤）（试剂配制和操作步骤） 试剂配制：（一）母液 （二）使用液 操作步骤：（一） 蛋白样品制备 （二） 蛋白含量的测定 （三） SDSPAGE 电泳 （四）转膜 （五）免疫反应 （六）化学发光，显影，定影 （七） 凝胶图象分析 关键词：关键词：印迹试剂 Western 印迹法 免疫反应 蛋白样品制备 SDSPAGE 电泳 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序 列的特异性试剂作为探针检测之。 Western 使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的 靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的
2、 复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 耗材耗材： 硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（2020cm），X-光片夹，X-光片， 玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， 试剂配制：试剂配制： （一）母液（一）母液 1.0mol/L TrisHCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存 。 PH HCl 7.4 约 17ml 7.5 约 16m 7.6 约 15ml 8.0 约 10ml 10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50水浴下溶解，室温保存。如
3、在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10过硫酸胺（过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，4保存，保存时间为 1 周。 1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最后用超纯水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存。 0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至 6.8，最后用超纯水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存。 20Tween20 Twee
4、n20 20ml 蒸馏水至 100ml 混匀后 4保存。 （二）使用液（二）使用液 单去污剂裂解液单去污剂裂解液 （50mmol/L TrisHCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100?g/ml PMSF） ： 1mol/L TrisHCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX100 0.5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后， 4保存。使用时，加入 PMSF 至终浓度为 100?g/ml（0.87ml 裂解液加入 1.74 mg/ml PMSF50l）。 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） NaCl 8.0g K
5、Cl 0.2g Na2HPO4 1.44g (Na2HPO4 .H2O 1.56g Na2HPO4 .12H2O 3.58g) KH2PO4 0.2g 蒸馏水至 1000ml G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝 G250： 100mg 95乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保 存。 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸馏水至 100 ml 高温灭菌后，室温保存。 100mg/ml 牛牛血清血清白蛋白（白
6、蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后，20保存。制作蛋白标准曲线时，用 0.15 mol/LNaCl 进行 100 倍稀释成 1mg/ml，20保 存。 10分离胶和分离胶和 5浓缩校浓缩校 10分离胶（两块胶，10ml） 5浓缩胶（两块胶，5ml） 10%AP（过硫酸胺） TEMED 加 TEMED 后，立即混匀即可灌胶。 还原型还原型 5XSDS 上样缓冲液上样缓冲液 （0.25mol/L Tris?HCl pH6.8，0.5mol/L 二硫叔糖醇，10 SDS，0.5溴酚蓝，50甘油） 0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2.5m
7、l 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g SDS 0.5g 溴酚蓝 0.025 甘油 2.5ml 混匀后，分装于 1.5ml 离心管中，4保存。 电泳液缓冲液电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L 甘氨酸，0.1 SDS） Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用 35 次。 转移缓冲液转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L 甘氨酸，0.037 SDS，20甲醇） 半干转半干转 1X1X 电转液：电转液： 甘氨酸（MW75.07）
8、2.9g Tris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用 35 次。 湿转湿转 1X1X 电转液：电转液： 甘氨酸（MW75.07） 11.25g Tris（MW121.14） 2.375g SDS 0.375g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml 溶解后 4保存，次溶液可重复使用 35 次。 TBS 缓冲液缓冲液（100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150mmol/L NaCl） 1 mol/ LTrisHCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g 蒸馏水至 1000ml TB
9、ST 缓冲液缓冲液（含 0.05Tween20 的 TBS 缓冲液） 20Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配。 封闭液封闭液（含 5脱脂奶粉的 TBST 缓冲液） 脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g TBST 100ml 溶解后 4保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。 洗脱抗体缓冲液洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2SDS，62.5m mol/L TrisHCl pH6.8） 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巯基乙醇) 700 l （通风厨里加） SDS 2g 0.
10、5mol/L TrisHCl（pH6.8） 12.5ml 超纯水至 100ml 配制时，在通风厨内进行。 4保存。可重复使用 1 次。 10X 丽春红染液丽春红染液 丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 蒸馏水至 100ml 使用时将其稀释 10 倍。 显影液：显影液：H2O 365ml A 125ml B 5.1ml C 4.875ml 4保存。 定影液定影液 H2O 363.5ml A 125ml B 11.5.ml 4保存。 抗体抗体 用 TBST 稀释至一定浓度使用，每张膜需 0.5ml 化学发光试剂化学发光试剂 购自北京中山公司，为 Santa Cruz 产品，分
11、A 和 B 两种试剂。 操作步骤操作步骤 SDS-PAGESDS-PAGE 转膜转膜 封闭封闭 一抗一抗 显色或化学发光显影显色或化学发光显影 二抗二抗 蛋白样品制备蛋白样品制备 洗膜洗膜 （一）（一） 蛋白样品制备蛋白样品制备 （1）贴壁细胞总蛋白的提取：（整个操作尽量在冰上进行） 收集细胞，加裂解液 100ul 漩涡混匀，冰上裂解 30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细 胞充分裂解。在 4下 12000rpm 离心 5min，取上清分装于 0.5ml 离心管中并置于20 保存。 （二）（二） 蛋白含量的测定蛋白含量的测定 （1） 制作标准曲线 1、 从20取出 1mg/ml BSA，室温
12、融化后，备用。 2、 取适量的蛋白标准稀释至终浓度 0.5 mg/ml ； 按照下表将 0.5mg/ml BSA 和稀释液 PBS 加到 96 孔板中，并取样品 2ul 加入 96 孔板中，加 PBS 至 20ul.（样品和标准品均设置复孔） 3、 按 A:B=50:1 配制适量的 BCA 工作液，混匀，室温 24h 内稳定。 各孔加入 200ulBCA 工作液 3730min 测定 A562，求平均值，绘制标准曲线。 （三）三） SDSPAGE 电泳电泳 电泳时间一般为 23h，电压为 80V 30min;120V 3h 较好，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止 电泳，进行转膜。 SDS-PAGE
13、分离胶浓度分离胶浓度最佳分离范围最佳分离范围 6%50-150kD 8%30-90kD 10%20-80kD 12%12-60kD 15%10-40kD 编号 12345678 0.5mg/ml BSA (ul) 01248121620 PBS(ul) 2019181612840 得到标准 BSA 浓度 (ugul) 00.0250.050.10.20.30.40.5 配制10%的过硫酸铵 配制12%分离胶（5ml) 待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加 入蒸馏水 聚合40分钟后，倒掉蒸馏水 配制5%浓缩胶（2ml）灌浓缩胶 插上梳子，聚合20分钟 注意：灌胶过程中避免产生气泡 （四）转膜（四）转膜 转膜详细操作过程：转膜详细操作过程： （1）转一张膜需准备 6 张 7.08.0cm 的滤纸和 1 张 7.38.6cm 的 PVDF 膜。切滤纸和 膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜则在 M-OH 中浸泡 10min 以上 后转入 TBS 液中平衡。将滤纸浸入 TBS 液中润湿。 （2）在加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和
