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1、实验一 底物浓度对酶促反应的影响1、 实验目的掌握底物浓度对酶活性的影响，了解碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的Km值的测定原理和方法，理解Km值的意义。二、实验原理在温度、pH及酶浓度等恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。当底物浓度较低时，酶促反应速度V随底物浓度S的增高而显著加快，随着底物浓度渐高，反应速度加快程度渐小，当底物浓度增加到一定程度以上时，再增高底物浓度，反应速度亦不再增加，成为该条件下极限最大反应速度Vmax。底物浓度与反应速度的这种关系可以用下列米曼（Michaclis-Menten）氏方程式表示。V=或Km=S( 1)式中，K
2、m为米氏常数。当V=Vmax/2时，则Km=S，即米氏常数是反应速度等于最大速度一半时底物物浓度的数值。如图所示： VVmax Km S图1 底物浓度与酶促反应速度的关系Km是酶的特征性常数，不同酶的Km值不同，同一酶作用于不同底物的Km值亦不同。大多数纯酶的Km值在0.01100mmol/L之间。Km值的测定在酶学研究中有重要的实际意义。根据实验结果绘制上述直角双曲线，难以准确求出Km和Vmax值。而用米曼氏方程式的下列变换式，则容易求得Km及Vmax值。米曼氏方程式中各项皆采用倒数表示，则成为LineweaverBurk氏方程式：=+ 如图所示： 斜率= 图2 LineweaverBurk
3、氏法作图求Km值这是个上截式直线方程式。与为直线关系，如上图。直线斜率为，纵轴截距为，横轴截距为.据此可以测定不同浓度底物的反应速度，按与关系作图而容易正确得出Km值。另有其他变换式，例如把上式两侧皆乘以S，则转换成Wilkinson氏方程式。=+S如图所示：斜率=-K m S图3 Wilkinson氏法作图求Km值这也是直线方程式。以为纵轴，S为横轴作图，则直线在横轴上的截距为Km.本实验利用磷酸苯二钠法测定不同浓度底物的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的反应速度，作图求出Km值。AKP的催化原理为：在一定pH和温度下，待测液中的AKP作用于基质液中的磷酸苯二
4、钠，使之水解释放出酚。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林(AAP)作用并经铁氰化钾氧化，生成红色醌类化合物。以酚作标准液同样处理显色进行比色，可测知酚的生成量，从而计算出酶的活力。三、实验器材试管、37水浴锅、可见分光光度计、座标纸。四、实验试剂1、0.04mol/L基质液 称取磷酸苯二钠 2H2O 10.16g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000mL。加4mL氯仿防腐贮于棕色瓶中冰箱保存，可用一周。2、0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液（含0.3% 4-氨基安替比林） 称取4-氨基安替比林（AAP）3g，用0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液溶解并稀释至1000mL，放棕色瓶内，冰箱
5、保存。3、酚标准液（1mg/mL）与酚标准应用液（0.1mg/mL）酚标准液（1mg/mL）：称取结晶酚1.0克溶于0.1N盐酸至1000mL。酚标准应用液（0.1mg/mL）：准确吸取酚标准贮存液（1mg/1mL）10.0 mL于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，贮存冰箱中可保存一个月。4、0.5铁氰化钾溶液称取5g铁氰化钾和15g硼酸，分别溶于400mL蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000mL，置于棕色瓶中暗处保存。5、0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液(37时)称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，稀释至1000mL。6、0.01mol/L pH
6、8.8 Tris缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1g，用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，此即为0.1mol/L Tris溶液。取上液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后用%醋酸调pH到8.8，用蒸馏水稀释至1000mL。7、酶液AKP（10mg，10U/mg）用0.01mol/L Tris缓冲液稀释成每mL含0.71.0单位的酶溶液。五、实验操作 取干净试管8支，编号，按下表操作。特别注意准确吸取酶液、基质液及标准液。管 号123456SB0.04mol/L基质液（mL）0.100.200.300.400.801.00水（mL）1.401.
7、301.201.100.700.501.501.50碳酸盐缓冲液（含AAP）（mL）1.501.501.501.501.501.501.501.50摇匀37，保温5min0.1mg/mL酚标准液（mL）0.10酶 液（mL）0.100.100.100.100.100.100.10充分摇匀，37准确保温15min0.5%铁氰化钾（mL）2.002.002.002.002.02.002.002.00混匀，室温放置10min以B管调零，读记在510nm处的各管光密度值OD，并填入下表，计算有关数据并作图。如按林贝氏法可如下进行：列表并计算记入各有关数据。底物浓度对酶促反应的影响管号t1t2t3t4t5t6S光密度ODV1/VS1/S(1) 计算出各管的酶活性单位ODt/ODs0.01，此数代表反应速度（V）。(2) 计算出各管底物浓度：基质液浓度=0.04(3) 进一步计算出各管的1/V及1/S值。 作图：以1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，在方格坐标纸上准确画出各管坐标点，连接各点画出直线，向下延长线与横轴交点为-1/Km值。计算出Km值。六、思考题联系实验结果，讨论底物浓度对酶促反应的影响。
