活性蛋白质的分离与应用ppt课件

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1、1,活性蛋白质的分离与应用,主讲：陈安珣,2,3,概述,蛋白质是一类由多种氨基酸结合而成的长链含氮有机高分子化合物，是生物体细胞的重要组成物质之一，是生命活动的基础。 活性蛋白质是一类具有特殊生理活性的蛋白质。,4,概述,活性蛋白质的存在范围： 活性蛋白质广泛分布于各种生物体组织，如动植物组织、动物乳汁、植物种子等中。,5,蛋白质的分类,活性蛋白质的种类非常多，一般根据来源与特性可分为：活性多肽、活性乳蛋白、天花粉蛋白、谷物蛋白、豆类蛋白、花生蛋白等。 蛋白质又可以根据蛋白质分子的化学组成和结构复杂程度分类，将其分为单纯蛋白质和结合蛋白质。单纯蛋白质是指结构比较简单，在组成上基本是单纯由氨基酸

2、构成的那些蛋白质。结合蛋白质是指结构比较复杂，由氨基酸和其他成分组成的那些蛋白质。单纯蛋白质又可以根据溶解度细分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白、硬蛋白、组蛋白、精蛋白、醇溶谷蛋白等。,6,活性蛋白质的性质,活性蛋白质是蛋白质中一类具有生物活性的蛋白质，像蛋白质一样，也是一类由多种氨基酸结合而成的长链高分子化合物，它具有所有蛋白质的一般性质，包括： 两性解离 等电点 胶体性质 变性 沉淀 显色反应,7,活性蛋白质的性质,1.两性解离： 蛋白质分子中含有多个可解离的酸性或碱性基团（酸性基团主要是C末端羧基及酸性氨基酸侧链的羧基，碱性基团有N末端的氨基及碱性氨基酸侧链的氨基、胍基及咪基）。可进行酸性解离或

3、碱性解离，所以说它具有两性解离的特性。,8,活性蛋白质的性质,2.蛋白质的等电点： 在一定的介质中，某一蛋白质解离成阴、阳离子的趋势相等，成为两性离子（净电荷为零），此时介质的pH值为蛋白质的等电点。不同的蛋白质所含酸性或碱性氨基酸的比例不同，等电点也不相同。根据蛋白质等电点的不同可以通过电泳进行分离蛋白质。,9,活性蛋白质的性质,3.蛋白质的胶体性质： 蛋白质属亲水胶体分子，如球状蛋白质相对分子质量在6000100万之间，直径在胶体颗粒的范围（1100nm），且球蛋白质溶于水，分子中的亲水氨基酸残基多位于颗粒表面，在水溶液中能与水起水合作用。所以蛋白质具有胶体性质，如丁达尔现象、布朗运动、不

4、能透过半透膜等。,10,活性蛋白质的性质,4.蛋白质的变性： 蛋白质在某些理化因素作用下，特定的空间结构被破坏而导致其原有的理化性质改变及生物活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。,11,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,12,活性蛋白质的性质,5.蛋白质的沉淀： 蛋白质沉淀是指蛋白质分子聚集，从溶液中析出的现象。 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋

5、白质能够从溶液中沉淀出来。,13,5.蛋白质的沉淀：,可逆沉淀 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,14,5.蛋白质的沉淀：,不可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生

6、物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,15,活性蛋白质的性质,6.蛋白质的显色反应： 常用的显色反应有以下几种。 （1）双缩脲反应 该反应知肽键常用的反应，即在碱性铜溶液中，肽键与铜离子行程络合物，呈紫色（在540nm有最大光吸收峰）。 （2）酚试剂法 该反应是比色法测定蛋白质的常用方法，即蛋白质以碱性铜溶液处理后，加用酚试剂，呈蓝色（在650nm有最大光吸收峰）。 （3）考马斯亮蓝法 即蛋白质与一种蛋白质染料考马斯亮蓝G250反应形成复合物，该复合物在595nm有最大光吸收峰。显色反应可用于蛋白质的检测分析。,16,蛋白质分离纯化的一般原则,蛋白质在组织或细胞中都是以复杂的混合物形式存在的，每种类型

7、的细胞都含有上千种不同类型的蛋白质。分离纯化的目的就是要从复杂的混合物中将所需要的某种蛋白质提取出来，并达到一定的纯度。因纯度是相对的，因此提纯的目标是尽量提高蛋白质的纯度或比活性（即增加单位重量中所需蛋白质的含量或生物活性），设法除去变性的和不需要的蛋白，并尽可能提高蛋白质的产量。 分离提纯某一特定的蛋白质，首先要使蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原有的天然状态（不失去生物活性）。为此，动物组织的细胞膜可用电动捣碎机或匀浆器破碎，细菌和植物的细胞壁可用超声波或加沙研磨等机械方法破碎，但更常用的是低温冰冻、化学试剂及溶菌酶处理。破壁后再用适当溶剂提取。,17,蛋白质分离纯

8、化的一般原则,获得蛋白质溶液后，再用适当的分离方法将所需要的蛋白质和其他蛋白质分开。一般采用等电点沉淀法、盐析和有机溶剂分级分离，然后再用离子交换、凝胶过滤等层析方法进行纯化。如果有必要和可能的话，还可用亲和层析以及各种电泳等方法进行高度纯化。 蛋白质分离提纯的最终目标往往是制成晶体，尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但是对蛋白质的纯化而言，结晶毕竟还是一个重要的步骤。因为结晶往往要经过反复多次的分级分离与提纯，直到某种蛋白质组分在数量上占优势时才能形成。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又是除去少量杂蛋白的有效措施。同时，由于变性蛋白不会结晶出来，因此蛋白质的结晶也是判断制品是否处

9、于天然状态的有力依据之一。,18,蛋白质分离纯化的一般原则,蛋白质纯度越高，溶液越浓就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态。这可利用控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH等方法来实现。 在制备具有生物活性的蛋白质（如酶制剂）时，需注意上述个步骤中蛋白质的变性、蛋白酶的作用以及微生物的污染等。,19,活性蛋白质的分离步骤,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、

10、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,20,蛋白质分离纯化的方法,对于蛋白质分离与纯化的方法，可以根据蛋白质的不同性质而加以选择。蛋白质的性质是指分子大小、溶解度、电荷、吸附性质及对其他分子的生物学亲和力等。,21,蛋白质分离纯化的方法,蛋白质分子都是大分子，在提取过程中，与混合物中的其他“杂质”相对分子质量相差较大，而且不同的蛋白质其大小也不同。根据这种性质而采用的分离方法有：,1.根据分子大小不同的分离方法,22,（1）透析和超过滤： 是根据蛋白质分子不能通过半透膜的性质使蛋白质和其他小分子物质

11、（如无机盐、单糖等）分开。常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸等合成材料。 透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里放在蒸馏水或流水中，蛋白质溶液中的无机盐等小分子通过透析袋扩散入纯水中以除去小分子。 超过滤是利用外加压力或离心力使水和其他小分子通过半透膜，而蛋白质留在膜内。 这两种方法只能将蛋白质和小分子物质分开，而不能将不同的蛋白质分离开。,23,（2）密度梯度离心： 蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，则质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，而每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停滞不前，最后各种蛋白

12、质在离心管中被分离成各自独立的区带。分成区带的蛋白质可以在管底刺小孔逐滴放出，分部收集，然后再对每个组分进行小样分析以确定区带位置。 常用的密度梯度为蔗糖梯度，在管底的密度最大，向上逐渐减少。密度梯度离心时对蛋白质有一种稳定作用，即可清除由于温度变化或机械振动引起的区带界面的扰乱。,24,（3）凝胶过滤： 凝胶过滤又称分子筛层析。这是根据分子大小分离蛋白质混合物有效的方法之一。凝胶过滤是一种柱层析，柱中的填充物是大分子的惰性聚合物，最常用的有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等。葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“网孔”大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到。不同型号的葡聚糖凝胶装在层析柱中

13、，不同分子的蛋白质混合物借助重力通过层析柱时，比“网孔”大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒的网格内，而被排阻在凝胶粒之外，随着洗脱剂通过凝胶粒外围而流出；比“网孔”小的分子则扩散进入凝胶粒内部，然后再可逆地扩散出来通过下层凝胶。这样，由于不同大小的分子所经过路程不同而得以分离，大分子先洗下来，小分子后洗下来。,25,凝胶过滤层析原理,26,蛋白质分离纯化的方法,各种蛋白质的溶解度大小在相同的外界条件下，主要取决于它们的结构特点，例如分子中极性的亲水基团与非极性的疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排布等。因此，根据各种蛋白质的不同溶解度，选择适当的外部条件，即能加以分离。,2.利用溶解度差别的分

14、离方法,27,（1）等电点沉淀法,由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间的静电斥力，因而容易聚集而沉淀，此时溶解度最小。由于不同蛋白质的等电点不同，所以调节pH达到某蛋白质的等电点时，则该蛋白质首先沉淀。这种方法分离出的蛋白质保持着天然构象，改变pH又可以重新溶解。,28,（2）盐溶与盐析,中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，这种影响具有双重性。低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐溶；高浓度的中性盐则可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质发生沉淀，这种由于在蛋白质溶液中加入大量中性盐，使蛋白质沉淀析出的作用称为盐析。对于难溶于水的蛋白质（如植物球蛋白），由于盐离子的加入增加了水溶液

15、的极性，减弱了蛋白质分子间的作用力，从而促进其溶解；但当加入的盐溶液浓度达到一定程度后，再继续加盐，蛋白质的溶解度反而降低，自溶液中析出。这是因为高浓度的盐与水结合后降低了水的相对浓度，争夺了蛋白质分子水膜层的水分子；而且中性盐都是强电解质，完全解离，离子浓度的增高大量地中和了蛋白质的表面电荷。换而言之，由于大量加入中性盐，破坏了蛋白质的稳定因素，因而发生沉淀。,29,不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，因而盐析时所需盐的浓度也不同。在蛋白质溶液中逐渐增大盐（常用硫酸铵）的浓度，不同蛋白质就会先后析出，这种方法称为分段盐析。血清中加入0.5饱和度的硫酸铵可使所有球蛋白沉淀下来，留在清液

16、中的蛋白质可以再用饱和硫酸铵使之沉淀。临床上可用此方法来测定血清中清蛋白与球蛋白的比例，作为诊断的一个指标。,30,（3）有机溶剂沉淀法,在蛋白质溶液中，加入一定量的与水相溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力大，能夺取蛋白质颗粒上的水膜，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮等。由于有机溶剂往往能使蛋白质变性失活，因此宜用稀浓度有机溶剂，并在低温（04）下操作。,31,3.根据电荷不同的分离方法,根据蛋白质所带电荷不同进行分离的方法主要是电泳与离子交换法。电泳的原理与氨基酸的电泳相同。各种蛋白质在电场中的运动速度取决于缓冲液的pH值及蛋白质分子的大小。缓冲液的pH与蛋白质的等电点相差愈大，蛋白质带电荷愈多，在电场中的移动速度就愈快。各种蛋白质的等电点不同，在某一pH时，所带电荷不同，加之，分子大小也不完全相同，因而就可以通过电泳将它们分离。 （1）毛细管区带电泳： 最常见的模式，用以分析带电溶质。样品中各个组分因为迁移率不同而分成不同的区带。为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁做化学修饰。 CZE分离多肽类物质主要是由不同组分中的化合物所带电性决定的，比传统凝胶