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1、第十节 产气荚膜梭菌检验,食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验 Microbiological examination of food hygiene Examination of Clostridium perfringens,魏氏梭菌,目录 1、概述 2、生物学特性 （菌体形态学特征、 培养特性和抵抗力） 3、毒素与分型 4、培养基和试剂 5、检验程序 6、说明, 09/uuoeoeoeuoeuuu.html,1、概述 产气荚膜梭状芽孢杆菌 又称魏/卫氏梭菌 分布：自然界广泛存在(创伤感染）。 易污染食品：动物性食品原料 食品加热后未及时冷却，所含耐高温而残余的产气荚膜梭菌芽孢会迅速发芽
2、，大量繁殖，菌数可达数10万/g，食用前又未加热，则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。 食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标是检验食品被该菌污染的程度，其重点项目是活菌数测定及证实试验。,2、生物学特性 1)形态与染色 G+(陈旧培养物阴性菌）无鞭毛可形成荚膜和芽胞的大杆菌 大小：为(12)m X(210)m 。 芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的 直径，有的菌株难形成芽胞。 荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基 内生长时可形成荚膜。,Clostridium perfringens,www.biol.vt.edu/research/micimm/index.php/ resea
3、rch/micimm/index.php,http:/oregonstate.edu/research/Images/SarkerSlide.jpg,www.uni-ulm.de/klinik/imi/mikrobio_2002/krankenversorgung/Diagnostik/Erreger/c_keim.htm/./ Diagnostik/Erreger/c_keim.htm,2)培养特性,*不严格的厌氧 *普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。 *适宜生长温度为3747。 *生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。 *在45高温下可进行快速分离纯培养，每培养3
4、4h 传种1次，较易分离纯化。,Clostridium Perfringens Toxin,dtirp.dtra.mil/./ agents/AgentsBW_toxins.asp,肝片肉汤培养： 大量产气，培养5h-6h变浑浊； 牛奶培养基中生长： 能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固 产生大量气体，冲散酪蛋白， 使其成海绵状。 庖肉培养基中培养： 产生大量气体，肉渣或肉块 略带粉红，但不消化。 普通琼脂平板上培养： 15h 24h形成S型菌落， 在营养不足或琼脂浓度 高的平板上可形成锯齿状带 放射条纹的R型菌落。,www.msu.edu/course/fsc/441/resulex10.html
5、/course/ fsc/441/resulex10.html,at 45C， Clostridium perfringens is virtually the only organism that will produce the Stormy Fermentation 。,鲜血琼脂平板生长： 菌落周围出现双层溶血环，内层溶血完全，外 层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带灰黄 色至浅灰褐色，与空气接触30min后，有时可能 逐渐变为灰绿色、甚至鲜绿色，这是本菌的特 征之一。,Clostridium perfringens shows double-zone hemolysis on bloo
6、d agar. Note the small area of beta hemolysis (complete lysis of red blood cells) surrounded by a larger zone of alpha hemolysis (partial hemolysis). The plate is sitting on a black lab bench,www.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanua/lab16/bloodcp.html/./ labmanua/lab16/bloodcp.html,Clostridium perfr
7、ingens Growing on Blood Agar,www.genomenewsnetwork.org/articles/01_02/Clostridium_seq.shtml/ articles/01_02/Clos.,www.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanua/lab16/bloodcp.html/./ labmanua/lab16/bloodcp.html,菌落周围出现乳光浑浊带，此反应能被本菌的 抗毒素抑制。 *由于发酵乳糖，菌落周围的培养基颜色发生变化 *本菌不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周围不出现透明环及虹彩层（肉毒梭菌可形成）。,ww
8、w.sat.affrc.go.jp/joseki/Anaerobes/Cl_perfringens.htm/./ Cl_perfringens.htm,乳糖牛奶卵黄琼脂平板上培养：,3) 生化特性 *发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气， *液化明胶 *还原硝酸盐为亚硝酸盐。 *能将亚硫酸盐还原为硫化物， 在含亚硫酸盐及铁盐 的琼脂中形成黑色菌落,*发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓暴风雨式发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。,www.woodsend.org/aaa/micro.html/ aaa/micro.html,4）抵抗力 A型与C型
9、菌株的芽胞：耐热性强，煮沸13h， 繁殖型菌体不耐热。,www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html/ japanese/virus23.html,3、毒素、酶与分型 毒素：产气荚膜梭菌能产生外毒素和肠毒素。 外毒素：致死毒素、坏死毒素和溶血毒素， 毒性不强不耐热。 肠毒素：不耐热，60经10min即可破坏不 耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶 等蛋白分解酶比较稳定。 酶 ：纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶等 这些毒素和酶促使组织分解、坏死、产气、水肿及病变扩散和全身中毒等。,分型： 根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成A，B，C ，D，E 和F六个型。 A型：
10、最常见，引起气性坏疽和食物中 毒； A型最早由Welch andNuttal(1892)分离， 所以叫卫氏/魏氏梭菌 C型：可引起肠炎。 *对人致病的主要是A、C和F型 *引起食物中毒的主要是A型,4、培养基和试剂 4.1 庖肉培养基 产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化 4.2 亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS） - 能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及 铁盐(含有柠檬酸铁胺)的琼脂中形成黑色菌落；前面 分离培养和计数用,（SPS）,4.3 液体硫乙醇酸盐培养基（FT） 大量培养该菌用,4.4 动力硝酸盐培养基 -无鞭毛，不运动； 还原硝酸盐为亚硝酸盐,4.5 含铁牛奶培养
11、基 -发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎 裂， 即所谓暴风雨式发酵”/“暴烈发酵”，这是本菌的 重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。观察2h， 5h不发酵为阴性,Iron Milk Medium. It is a medium used in Most Probable Number analysis of Clostridium perfringens. When placed at 45C, CP is virtually the only organism that will produce the Stormy Fermentation (seen in the ri
12、ght tube). The coagulation of milk fat forms a plug thereby restricting oxygen (which is necessary for this strict anaerobe). Stormy fermenation usually occurs within 6 to 8 hours,www.msu.edu/course/fsc/441/resulex10.html/course/ fsc/441/resulex10.html,4.6 卵黄琼脂培养基 检查卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶阳性，接种点（每个平板接 种10点以上）的底
13、部及其周围形成乳白色的浑浊带。 4.7 0.1 蛋白胨水稀释剂； 4.8 硝酸盐还原试剂:甲萘胺液和对氨基苯磺酸液； 4.9 革兰氏染色液。,www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.htmlhtml,肉毒梭菌,对比,5、检验程序,计数30300个 菌落的稀释倍数,活菌计数培养,检验程序续,36，1824h,36，24h ,46,25h 爆发酵,无,6、说明 1活菌计数培养 ：1：10稀释的样品用蛋白胨水依次 稀释至10-210-6倍，取1ml放入2个平板，分别加 15ml SPS琼脂，于36培养24h，选取长有30300 个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。,
14、www.msu.edu/course/fsc/441/resulex10.html/course/ fsc/441/resulex10.html,2、证实试验 (1)纯培养：由平板上任取10个黑色菌落，分别接种 FT培养基，于(361)培养1824h，大量繁殖。 (2)菌体形态和染色检验：用培养液涂片，革兰氏 染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性 粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于 菌体中央或近端。,(3)检查动力和硝酸盐还原实验： 用接种环(针)穿刺接种动力硝酸盐培养基，于(36 1)培养24h. -判断有无动力-产气荚膜梭菌无动力； -滴加硝酸盐还原试剂“甲萘胺液和对氨基苯磺酸液”各0.5
15、ml，观察硝酸盐是否被还原-产气荚膜梭菌，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 （红色）,25,(4)牛乳乳糖发酵产气“暴发酵”试验： 取生长旺盛的FT培养 液1ml接种于含铁牛乳培养基，在46水浴中培养 2h后观察有无“暴发酵”现象。5h内不发酵者为阴性。 产气荚膜梭菌发酵乳糖，产酸凝固酪蛋白并大 量产气，呈“暴风雨式发酵”现象，但培养基不变黑。,(5)卵磷脂酶检查试验：用接种环取FT培养液点种于卵黄 琼脂平板(每块平板 至少可接种10点)，于厌氧 培养，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵 磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及 周围乳白色的混浊带。,3、菌数计算 根据黑色菌落的计数和证实试验的结果，计算1 g(ml)食品检样的含菌数。 例如：104稀释液的平板长有黑色菌落100个，而供做证实试验的10个菌落中有7个被确证为产气荚膜梭菌，则1g(mL)食品检样所含产气荚膜梭菌数为 计算：,www.msu.edu/course/fsc/441/resulex10.html/course/ fsc/441/resulex10.html,复习题,1、食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标就验食品被该菌污染的程度，因此，其检验的重点项目是活菌数测定及证实试验。能引起奶中乳糖暴发酵。 2、对产气荚膜梭菌的检验程序进行说明。,
