《RNA干扰技术原理及应用ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RNA干扰技术原理及应用ppt课件（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、RNA干扰及其应用,RNAi的发现,1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。,RNAi的提出,直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表
2、达。 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。,RNAi广泛存在于自然界,随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。,1、RNAi 机制,体外实验结果的提示,体外实验
3、表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？ 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。,RNAi作用的简单模型,当dsRNA导入细胞后，被一种
4、dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。 通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。,RNAi研究的一般
5、技术路线,2、siRNA 的设计,何为siRNAs,越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。 如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。,一般设计原则,（1）从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
6、Tuschl等建议不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。,负对照,一个完整的siRNA实验应该有负对照。 作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组
7、成，但是和mRNA没有明显的同源性。 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。,3、制备siRNAs的方法,（1）化学合成,尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。 由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究； 不适用于：筛选siRNA等长时间的
8、研究，主要原因是价格因素,（2）体外转录,相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。 更重要的是能够更快的得到siRNAs。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。 不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。,Figure. Use of Chemically Synthesi
9、zed and in Vitro Transcribed siRNAs targeting -Actin to Induce Gene Silencing.,（3）用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA,其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。 这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。 这个方法是选择通常是2001000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。 在除掉没有
10、被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。,（3）用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA,dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III比用Dicer要便宜）。 不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。 现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
11、不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗,Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls.,（4）siRNA表达载体,多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。 之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分
12、子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。 使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。,由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。 不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。,（4）siRNA表达载体,毫无疑问，siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这
13、也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。 开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。 最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）,Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three weeks following select
14、ion, the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP levels were remarkably reduced (94%) in cells transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to those transfected with an empty s
15、iRNA expression vector.,HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert.,（5） siRNA表达框架,siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，
16、能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。 和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。 因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配！,（5） siRNA表达框架,如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。 构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。 这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。 最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子； 不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了） 。,72 hours post-transfection,
