免疫组织化学(免疫组化)技术 修订-可编辑

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1、免疫组织化学（免疫组化）技术 利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry IHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）。其特点是将形态学改变与功能，代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量分析。 第一节 免疫组化的发展史及应用自1941年 Coons及其同事首创免疫组织化学技术以来，拌

2、随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日新月异的变化。如下表 免疫组化的发展过程年代 研究者 事件 1941Coons实用免疫萤光技术1948Fagraeus进一步发展免疫萤光技术1970Sternberger抗体酶标技术1974Taylor证实组织中浆细胞免疫组化1975Kohler Milstein单克隆抗体技术（被成为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞）。1981HsuABC法1990 至今SP法、原位杂交免疫组化技术 由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态与功能研究有机的结合在一起，所以，这门技术从一诞生

3、起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，推动了学科的发展，取得了令人瞩目的成就。免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。免疫组化可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定，淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞

4、水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，拌随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。越来越多的癌基因与抗癌基因的发现不仅有助于对肿瘤发生机制的探讨，而且使肿瘤的预防，早期诊断，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。在国外，病理诊断免疫组化开始于70年代，80年代发展至高峰，90年代已列入病理技术室常规工作。在国内，免疫组化到90年代才开始在病理诊断中逐渐普及。第二节 免疫组化的基本原理基本原理：众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组织化学正

5、是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。反之亦然。由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。如前所述，免疫组化主要涉及免疫学和组织化学的有关理论和技术，其中关键在于制备高效的抗体，后者又主要取决于抗原的质量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。在抗体制备上，经历了从

6、抗血清，纯化IgG到单克隆抗体，甚至发展到应用基因重组技术获得分子量较小的特异性片段。就单克隆抗体而言，它是在 1975年由 Kohler 和 Milstein 建立了杂交瘤技术后才开始问世的，现已被广泛应用于研究中，它具有更好的特异性，大大地提高了免疫组化的技术水平。显示技术的发展也相当迅猛，早期只是简单的将标记物结合在抗体上，以后则发展到将标记物结合在抗抗体上或与抗体具有特异亲和性的分子上，用于标记的物质有很多种，如荧光染料、放射性同位素、酶、胶体金等。借助于荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜，就可观察到这些标记物发出荧光、酶促反应产生的有色沉淀或高电子密度颗粒，从而观察到抗原抗体复合物所

7、再的部位。由此可见，免疫组化技术以其特异性和灵敏度高等特点，又因其操作比较简便而得以广泛应用。第三节 有关的免疫学理论抗原（antigen）：抗原应具备的条件： 异物性理化性质特异性 抗原的种类： 免疫原性与免疫反应性完全抗原不完全抗原抗原与机体的亲缘关系 异种抗原 同种异型抗原 自身抗原抗原的化学结构 蛋白质抗原 多糖抗原 核酸抗原低分子量物质抗原合成多肽抗原抗原的理化性状 颗粒性抗原 可溶性抗原 抗原的制备：材料的准备和预处理组织的粉碎抗原的提取抗原纯化抗原纯度的检测半抗原的免疫原制备法抗体（antibody） 是机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反

8、应的球蛋白，称免疫球蛋白（immunolobulin,Ig）,共有五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,主要分布在血清或外分泌物中。 抗体的分子结构抗体的理化性质抗体与抗原的特异性结合抗体的种类 抗体的抗原性： 同种型抗体 同种异型抗体 独特型抗体 抗体的制备方法： 多克隆抗体（血清抗体）指机体接受抗原的主动免疫或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。 单克隆抗体是1975年由Kohler和Milstein发明的一种新技术。原理是将体外培养的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞系既有骨髓瘤细胞无限生长的能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。这种免疫细胞通过纯化，成为单

9、克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，既单克隆抗体。这一技术被称为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞。（祥见图解） 单克隆抗体与多克隆的特性比较见下表:单克隆抗体与多克隆的特性比较特 性 单克隆抗体 多克隆抗体 组成 特异性 亲合力 交叉反应 单一类的抗体 高，针对单一抗原决定簇 不定，较低 低 多种类抗体的混合物 低，针对多个抗原决定簇 平均亲和力较高 高 第四节 免疫组化的基本技术根据标记物（或示踪物）不同可分为以下技术： 免疫荧光组化技术免疫酶组化技术亲合免疫组化技术 免疫胶体金组化技术免疫铁蛋白技术还有双重和多重标记技术等。不同的免疫组化

10、技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色，对照试验，显微镜观察等步骤。(一)免疫荧光组化技术1. 基本原理 根据抗原抗体反应原理，先将已知的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针与细胞或组织内相应抗原结合，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本（荧光素受荧光显微镜激发光的照射而发出一定波长的荧光），从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。2. 分类 直接法 间接法 补体法 双重免疫荧光标记法1) 直接法用荧光标记的特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（第一抗体）直接与标本

11、反应（染色），以检测标本中相应的抗原。如图 特点： 操作简单，特异性高，但敏感性低，且由于一种荧光标记抗体只能检测一种特异性抗原，所以应用范围较这窄。染色步骤: 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定。 必要时用酶适当消化。 用PH7.4 PBS洗15分钟。 滴加经适当稀释的荧光抗体，室温或37孵育箱内孵育3060分钟。 用PBS洗3次，5分钟/次。 用50%甘油（用PH 9.0 碳酸盐缓冲液配制）封片 荧光显微镜下观察。2) 间接法 此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再

12、用间接荧光抗体（也称第二抗体）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原抗体荧光抗体的复合物。如图 由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如 细胞抗原上每个分子结合35个分子的抗体，当此抗体作为抗原时又可结合35个分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。 特点：特异性强，灵敏度高，应用更广，只需要制备荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔即可应用于多种抗体（第一抗体）的标记显示。 染色步骤： 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定 必要时用酶适当消化。 用PH7.4 PBS洗15分钟。 滴加经适当稀释的未标记一抗，在室

13、温或37孵育箱内孵育3060分钟。 用PBS洗3次，5分钟/次。 滴加荧光标记二抗，在室温或37孵育箱内孵育3060分钟。 用PBS洗3次，5分钟/次。 用50%甘油（用PH 9.0 碳酸盐缓冲液配制）封片 荧光显微镜下观察。3) 补体法大多数抗原抗体复合物都能结合补体。因此，在染色时先将新鲜补体与第一抗体混合，同时加在抗原标本切片上，经37 孵育后，如发生特异抗原抗体反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体补体荧光抗体的复合物。如图 特点：只需一种荧光抗体，可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检测。 染色步骤：1 石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定 必要时用酶适当消化。 用PH7.4 PBS洗15分钟。 将抗血清60灭活20min，并作适当稀释。 将新鲜豚鼠血清（其中含有补体）稀释10倍 取等量抗血清和豚鼠血清混合，滴加在