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1、液相色谱的方法开发,分离机理及色谱柱,选HPLC参数时的基本考虑,溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何? 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 - 分析、制备都考虑 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异 摸索条件的重要线索,极性问题,液相色谱的分离机理,正相 反相 体积排除 离子交换 其他 不同的分离模式是不同的机理,吸附色谱的分离机理,随着样品在固定相上的吸附能力由大到小 在色谱柱上的保留由长到短,吸附色谱概述,分离基于样品的极性差异。 洗脱次序一般为正相，即：极性低的
2、先被洗脱 常用的流动相 非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂 常用固定相 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。,分配色谱的分离机理,分配色谱概述,反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相?,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点 pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,
3、体积排除色谱的分离机理,凝胶色谱概述,凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC） 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测,GPC的校正,分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离,离子交换树脂的分离机理,离子交换色谱概述,适用于离子型化合物的分离 分离基于离子的带电特性 洗脱次序受多种因素的影响 填料（离子交换树脂）的种类阴/阳，强/弱，交换基团 样品分子特性 盐的种类、浓度 温度及pH值 有机溶剂,离子交换树脂的交换容量,液相色谱柱及分离机理的关系,从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受,
4、从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合,色谱柱化学及外形结构的关系,对HPLC柱的了解,平均颗粒度，颗粒度分布 颗粒度(dp) 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) 颗粒分布 颗粒分布越宽柱效低(渗透性差) 颗粒形状 球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱的了解（二）,平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布 大的孔径可分析高分子量的分子,对HPLC柱的了解（三）,键合相化学 影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN,对H
5、PLC柱的了解（四）,含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加） 高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱C% k苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C181917 Zorbax ODS1715.7 LiChrosorb RP-181510.3 Symmetry C81212.5 Resolve C-181212.4 Ultrasphere ODS1111.3 Partisil ODS-31112.0 mBondpak C-1810 7.9 No
6、va-Pak C-18 7 5.5,对HPLC柱的了解(五),填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）,残基处理的效果,NovaPak C18,未封口 C18, 抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺,对HPLC柱的了解（六）,硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志,对HPLC柱的了解（七）,填料的稳定性 硅胶填料 pH：2-8 聚合物填料 pH：2-12 pH值小于2时键
7、合相水解,Waters各种硅胶基质的色谱柱,Waters不同品牌的色谱柱,mBondaPak 文献背景强, 是工业标准 平均孔径125A，10m高活性、无定形硅胶 中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性 Nova-Pak 平均孔径60A，4m高韧度低活性球形硅胶 低酸性，高疏水性，好的端基封口 有利于小分子物质的分析,Waters不同品牌的色谱柱,Resolve 平均孔径90A，5/10m低活性硅胶 非常高的疏水性，无端基封口 有利于低保留的中性及酸性化合物分离 Delta-Pak 有100A和300A两种孔径，5/15m硅胶 中到高的疏水性，端基封口 适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱,新一代硅胶基质的色谱柱,Symmetry 高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点 好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长,Waters聚合物基质的反相柱,特殊设计的多孔聚合物胶 有很宽的 pH 适应范围（2-12） 可用离子抑制方法分析碱性化合物 有非常不同的选择性 柱效及韧性比相应的硅胶柱低 色谱机理不太清楚 文献背景低，用户少,色谱柱的规格,内径 检测的灵敏度 样品的容量 长度 分离度，理论塔板数 速度 样品的容量 检测的灵敏度,
