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1、LC/MS技术原理及应用 药物代谢产物结构鉴定,2016-12-3,2,质谱技术与诺贝尔奖,If the periodic table is the “alphabet” of chemistry, then molecules are “words”, and chemical reactions and interactions are “sentences”. One important tool to observe the language of chemistry is liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS).,质谱原理简介,
2、质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的棒图就是我们常见的质谱图。,常见术语,质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/z (mass-to-charge ratio ). 峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰. 离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度. 基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰. 总离子流图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子,6,质谱检测,回答分析化学中最常见的问题
3、 定性 - 样品中有什么? 定量- 样品中有多少?,MS: Mass Spectrometry,7,质谱仪的特点,真空系统,样品入口,检测器,数据系统,质量分析器,离子源,大气 atmospheric pressure ionization,离子源 离子生成 质量分析器 离子分离 检测器 离子收集,8,真空对质谱有何重要性？,低真空,高真空,带电离子,检测器,检测器,气体分子,9,离子源,10,色谱-质谱联用技术接口（离子化方法）,GC/MS,LC/MS,电子轰击离子化 EI,化学电离离子化 CI 正化学电离离子化 PCI 负化学电离离子化 NCI,大气压离子化 API: atmospheri
4、c pressure ionization 电喷雾离子化 (ESI: electrospray ionization) 大气压化学电离离子化 (APCI: atmospheric pressure chemical ionization) 大气压光电电离 (APPI: atmospheric pressure photo ionization),11,电喷雾离子化（ESI）过程,12,大气压化学离子化（APCI）过程,13,ESI和APCI离子化方式对比,生成离子的方式不同：ESI：液相离子化；APCI：气相离子化 样品兼容性ESI：极性化合物和生物大分子APCI：非极性，小分子化合物（相对E
5、SI而言），热稳定，具有挥发性 流速兼容性ESI-0.001到1ml/minAPCI-0.2到2ml/min ESI的适用范围要远远大于APCI 复杂样品分析时，APCI相对于ESI不易受到基质效应影响,14,哪种离子化方式？,15,质量分析器,16,质量分析器,离子阱质量分析器 (Ion trap, IT) 四极杆质量分析器 (Quadrupole, Q) 飞行时间质量分析器 (Time-of-flight, TOF) 扇形磁场和静电场 (Sector, E 38: 357372.,60,代谢产物分子量变化,61,阿比朵尔人体内代谢产物鉴定,阿比朵尔是已经上市的广谱抗病毒药物 预防和治疗流行
6、性感冒药，通过抑制流感病毒脂膜与宿主细胞的融合而阻断病毒的复制,62,代谢实验方法 两名健康男性志愿者口服2粒阿比朵尔胶囊(200 mg)，收集服药前和服药后024 h尿样 部分尿样通过葡萄糖醛酸苷酶水解 分析仪器 Agilent 1200 HPLC system Agilent 6300 LC/MSD Trap XCT ultra Waters Acquity UPLC Waters Q-TOF Synapt MS,阿比朵尔代谢产物鉴定,63,阿比朵尔的一级质谱图（离子阱质谱仪）,64,阿比朵尔的二级质谱 (m/z 477),- 45 Da,- 44 Da,65,- 44 Da,- 109
7、Da,阿比朵尔的三级质谱 (m/z 477 432),66,- 109 Da,- 28 Da,- 79 Da,阿比朵尔的四级质谱 (m/z 477 432 388),67,- 44 Da,- 28 Da,阿比朵尔的四级质谱 (m/z 477 432 323),68,阿比朵尔的质谱解析,Br,69,通过全扫描质谱分析，检测到17个代谢物，包括5个一相代谢物和12个二相代谢物，它们都含有79Br/81Br同位素模式 M1 m/z 463( 14 Da) M2 m/z 493 (+ 16 Da) M3 m/z 479 (+ 16 14 Da) M4 m/z 509 (+ 32 Da) M5 m/z
8、495 (+ 32 14 Da),鉴定人尿中阿比朵尔代谢产物,70,阿比朵尔及其代谢物的液相色谱和多级质谱数据,Metabolite identification of arbidol in human urine by the study of CID fragmentation pathways using HPLC coupled with ion trap mass spectrometryYuya Wang, Xiaoyan Chen, Qiang Li and Dafang Zhong,Agilent 1200 HPLC system Agilent 6300 LC/MSD Tra
9、p XCT ultra,Wang YY, Chen XY, Li Q, Zhong DF. J Mass Spectrom, 2008,UPLC-Q/TOF MS鉴定人体内阿比朵尔代谢物,仪器：Acquity超高效液相色谱系统及Synapt Q-TOF质谱仪（美国Waters公司）。 UPLC-UV条件：Acquity UPLC BEH C18 (2.150 mm, 1.7 m)梯度洗脱。紫外检测波长316 nm。 Q/TOF 质谱条件：ESI源，正离子检测，喷雾电压为3.0 kV；雾化气流量800 L/h，去溶剂温度350oC；离子源温度100oC；MSE高能量扫描时Transfer CE为
10、15 ev，Trap CE为1530 eV；低碰撞能量时Transfer CE为2 ev，Trap CE为3 eV 。,Metabolynx parameters file setup,受试者尿中阿比朵尔代谢物谱,-葡萄糖醛酸酶水解前,31种代谢物,M0,阿比朵尔及其代谢物对照品,阿比朵尔,阿比朵尔砜,N-去甲基阿比朵尔砜,4-羟基阿比朵尔,阿比朵尔亚砜,N-去甲基阿比朵尔亚砜,阿比朵尔的质谱裂解规律,477.082,M + H+/M + H + 2+,阿比朵尔亚砜的质谱裂解规律,493.078,M + H+/M + H + 2+,阿比朵尔及其代谢物对照品的质谱裂解规律,阿比朵尔,阿比朵尔砜,
11、N-去乙基阿比朵尔砜,4-羟基阿比朵尔,阿比朵尔亚砜,N-去乙基阿比朵尔亚砜,79,阿比朵尔硫酸酯,- 80 Da,- 176 Da,阿比朵尔葡萄糖苷酸,结合型代谢产物鉴定,受试者血浆和尿中阿比朵尔的代谢产物,阿比朵尔在人体内代谢途径,82,阿比朵尔及其代谢物的质谱断裂特点,作为化学键均裂的结果，阿比朵尔及其代谢物有共同的断裂模式，这种断裂生成奇电子离子，失去自由基 阿比朵尔、N-去甲基阿比朵尔、阿比朵尔砜、N-去甲基阿比朵尔砜的质谱裂解特点是：首先丢失甲胺(45 Da), 然后丢失乙醛 (44 Da), 再丢失苯硫自由基(109 Da) 具有亚砜结构的代谢物，首先断裂苯亚磺酰基自由基 (12
12、5Da)，然后丢失甲胺 (45 Da)和乙醛 (44 Da).,83,阿比朵尔结合型代谢物的质谱断裂特点,阿比朵尔、N-去甲基阿比朵尔、阿比朵尔砜、N-去甲基阿比朵尔砜结合型代谢物的质谱裂解特点是：首先丢失SO3（80 Da）或葡糖醛酸（176 Da） 具有亚砜结构的代谢物，首先断裂苯亚磺酰基自由基（125 Da），然后丢失SO3（80 Da）或葡糖醛酸（176 Da）,84,结论,液相色谱的良好分离是鉴定代谢产物的必要条件 多级质谱提供了丰富的结构信息 高分辨质谱提供的准确分子量信息有助于代谢产物的快速鉴定 鉴定代谢产物结构还需要 合成或分离代谢物对照品 核磁共振光谱 酶水解 深入理解药物代谢反应和质谱裂解规律,1、质谱仪主要是由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、 数据记录系统组成的；,2、ESI和APCI的区别和应用；,3、质谱检测器种类；,4、质谱扫描模式及应用,
