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1、毕业论文开题报告生物工程香鱼Apo AI原核表达及鉴定一、选题的背景与意义香鱼属胡瓜鱼目香鱼科。地方又名香油鱼、瓜鱼、细鳞鱼、海胎鱼、秋生子，日本人称为鲇鱼。是一种中小型名贵鱼类，曾被列入“雁荡五珍”，在亚洲被誉为“鱼中珍品”。因其脊背上有一条满是香脂的腔道能散发出浓郁的芳香味而得名。香鱼肉质细嫩多脂，清香可口，无鱼腥味，比一般鱼类口感好，尤其是凫溪香鱼干，早在清代已远近闻名。香鱼营养丰富，其肌肉粗蛋白中含人体必需氨基酸含量高达6885，要比其他淡水鱼高出许多。香鱼为滤食性鱼类，在自然条件下，鱼苗主要摄食浮游动物和贝类幼体；长大后以石砾上附生的硅藻、蓝藻及绿藻类为食。人工养殖香鱼，蚕蛹、螺肉、
2、剁碎的鲜杂鱼虾及小麦粉、马铃薯、黄豆、米糠、青菜等均可作为饵料，也可使用香鱼专用饵料或鳗饵料。香鱼的分布范围很广，除我国外，日本、朝鲜也有分布。香鱼的人工养殖始于日本，中国的浙江省已有试验，河北省已养殖成功，台湾省则较为盛行。Apo AI是高密度脂蛋白(HDL)的主要组成蛋白，它能与磷脂、多种血浆因子及细胞受体结合，可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，起着促进细胞内胆固醇的移出、酯化、转移以及调节HDL代谢的作用。载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要的生理功能。一般认为载脂蛋白至少有下列五方面功能：与脂质的亲和作用，使脂质溶于水性介质中；运输胆固醇和甘油三酯；作为脂蛋白外壳的结构成分，它能将各种脂质成分
3、（胆固醇、甘油三酯和磷脂）结合在一起形成一个整体，与脂蛋白外生物信息相联系；以配体的形式作为脂蛋白与特异性受体的连接物；激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类。Apo AI的临床意义在于它的测定可以直接反映高密度脂蛋白胆固醇的水平，从而了解冠心病、糖尿病等疾病的严重程度。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容：本课题通过构建香鱼Apo A-I原核表达载体，并转入大肠杆菌BL21 pLys E进行诱导表达目的蛋白，为进一步基因功能研究奠定基础。拟解决的问题：香鱼Apo AI原核表达及鉴定。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1引物设计根据已获得香鱼Apo A-I基因序列设计原核表达
4、引物：pApo A-I-1（+）：5-CCATATGCGTACCTTGCAGGCTGATGA-3；pApo A-I-1（-）：5-GGAATTCTTATGCCTTAATGGACTCGCT-3（下划线为添加的限制性内切酶Nde和BamH的识别序列）。2原核表达载体构建2.1 PCR产物切胶纯化以1.2.1中原核表达引物配对进行PCR扩增，PCR产物与10Laoding Buffer混合，并在1%（w/v）琼脂糖凝胶中电泳（120V），EB染色后漂洗，紫外灯下观察，切下预期大小的目的片段，用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit（OMEGA）纯化，具体方法如下：1)手术刀切下含
5、有目的片段的凝胶并置于Eppendorf管中，加300l Binding Buffer后置5560水浴10min，每隔23min颠倒混匀一次，至凝胶完全溶解；2)将混合液混匀后转入蓝管，10000g离心1min；3)加300l Binding Buffer，10000g离心1min；4)弃滤液，加700l Wash Buffer于蓝管中，10000g离心1min；5)弃滤液，另加700l Wash Buffer于蓝管中，10000g离心1min；6)弃滤液，13000g离心2min，彻底去除蓝管中的Wash Buffer残留；7)加入30l Elution Buffer于蓝管，室温静置1min
6、，13000g离心1min，收集产物-30保存。2.2感受态制备采用CaCl2法制备感受态细胞，具体方法如下：1)接种-80长期保存的大肠杆菌菌株到5ml LB（每升含10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl，pH 7.0）液体培养基中，37摇床，200rpm，培养过夜（12h左右）；2)按1:100比例取50l母液稀释到新鲜的5ml LB液体培养基中，继续37摇床培养，200rpm，培养2 h；3)取出菌液置冰上冷却10min，将冰冷的菌液1ml每管分装到1.5mL的Eppendorf管，8000g离心1min，弃上清；4)沉淀用200l预冷的0.1mol
7、/L CaCl2悬浮，冰浴30min后，8000g离心1min，弃上清；5)沉淀再用100l 0.1mol/L CaCl2重悬浮，冰浴放置524h备用。2.3转化和筛选克隆1)将10lPCR产物加到100l感受态细胞中，移液枪轻轻吹打混匀冰浴放置30min；2)在42水浴条件下热激90s，立即转移到冰上冷却2min；3)加入冰预冷的LB培养液总体积至1ml，37摇床低速（170180rpm）培养1h；4)在预先均匀涂布X-gal和IPTG的LB平板上（液体LB培养基中添加1.5%琼脂粉），取100l转化后的培养菌液，涂布于含氨卞青霉素（50g/mL），37培养箱培养过夜（1014h）；5)筛选
8、白色菌落置5ml含氨卞青霉素（50g/mL）的LB培养液，在37摇床，200rpm，培养812 h。2.4质粒提取根据质粒在下游实验中用途不同，我们用不同的方法抽提质粒，其中用于检测和筛选阳性克隆采用采用碱裂法小量抽提质粒。用于双酶切的质粒采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I试剂盒（OMEGA）精抽纯化。裂解法（粗提质粒）：1)取1ml菌液于1.5ml的Eppendorf管中，8000g离心1min，弃去上清；2)加入溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl pH 8.0）100l，剧烈震荡使细胞悬浮；3)加新配制的新鲜溶
9、液II（0.2mol/L NaOH，1%SDS）200l，轻柔颠倒数次，待菌悬浮液澄清；4)加入150l溶液III（3mol/L Kac，2mol/L HAc），混匀后13000g离心10min；5)将380l上清转移至新的Eppendorf管中，加入异丙醇720l，颠倒数次13000g离心10 min；6)弃上清，沉淀经自然干燥后加50l无菌水溶解。2.5重组质粒的鉴定将碱裂法抽提的质粒与10上样缓冲液混匀后，1%琼脂糖凝胶电泳，选择大小合适的重组质粒进行PCR检测，PCR检测体系如前。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离。鉴定为目的重组质粒后，将目的菌株的菌液加10%甘油混匀后置于-80保存
10、。2.6原核表达载体的克隆1)按（1.2）步骤获得含有目的基因的克隆。2)采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I试剂盒（OMEGA）分别纯化质粒pET-22b（+）和PCR产物。3)对纯化的质粒进行双酶切，反应体系如下：纯化的质粒16 l10K缓冲液2 lBam H I 1 lNde I1 l反应总体积20 l37水浴2h4)切胶纯化：酶切后产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，用切胶纯化试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit（OMEGA）纯化，步骤如前所述。5)连接采用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit ver.2，pET-2
11、2b（+）载体反应体系如下：双酶切基因产物4 lpET-22b(+)1 lSolution I5 l反应总体积10 l16连接30min后，4过夜6)将连接产物转化至TG1菌株，涂于含氨苄青霉素（50g/mL）的LB培养基上，筛选所需的克隆，经PCR进一步确定。2.7Apo A-I-1基因的原核表达和检测1)采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I试剂盒（OMEGA）纯化目的质粒。2)转化至BL21 pLys E菌株，涂于含氨苄青霉素（50g/mL）的LB培养基上，过夜培养（1014h）。3)诱导：挑选单个菌落接种于5ml LB培养液（含50 g/mL氨苄青霉素），37摇床培养
12、过夜。取50l按1:100比例稀释接种LB培养液（含50g/mL氨苄青霉素）5ml中，2h后，取1ml作为对照，其余培养液中加入IPTG（终浓度为0.4mmol/L），继续培养2h。4)检测：取1ml菌液于1.5ml的Eppendorf管，8000g离心1min，菌体加100L 2SDS-PAGE上样缓冲液（50mmol/L Tris-HCl pH 6.8，100mmol/L DTT，2%SDS，0.01%溴酚蓝，20%甘油），煮沸5min，10000g离10min后，取上清20l进行SDS-PAGE电泳，用未诱导的菌体和BL21 pLys E菌体蛋白作对照，进行电泳。样品在进入分离胶前用80
13、V，进入分离胶后加至95V。5)染色与脱色：电泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝胶，切去浓缩胶，同时切一角作为方向标记，蒸馏水冲洗。用考马斯亮蓝R-250（0.25% Coomassies bright blue R-250）染色，室温下，染色30min后转至脱色液，漂洗至凝胶背景无颜色，蛋白条带清晰，观察是否表达。（二）技术路线目的基因的引物设计总RNA提取及反转录香鱼肝目的基因的扩增双酶切pET-22（+）片段回收连接及转化重组质粒的鉴定诱导表达及鉴定双酶切片段回收四、研究的总体安排与进度2010.9-2010.10 毕业论文选题2010.10-2010.12 进行文献查阅和资料收集，.完成开题报
14、告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。2010.12-2010.12 试验相关试剂的准备。2010.12-2011.1 构建香鱼Apo AI原核表达载体和香鱼Apo AI的原核表达及鉴定。2011.1-2011.2 数据和材料整理、分析。2011.2-2011.3 完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。2011.4-2011.4 开题答辩与综述。五、主要参考文献：1 Maciejko JJ, Holmes DR, Kottke BA, et al.Apolipoprotein A-I as a marker of angiographically assessed coronary-art
15、ery disease J. N Engl J Med, 1983, 309(7): 385-389.2 Kottke BA, Zinsmeister AR, Holmes DR Jr, et al. Apolipoproteins and coronary artery disease J. Mayo Clin Proc, 1986, 61(5): 313-320.3 Brewer HB, Bronzert TJ, Houser A,et al. The amino acid sequence of human Apo a-I, an apolipoprotein isolated from high density lipoproteinsJ. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1978, 80(3): 623-6304 徐勇霞，付明德.载脂蛋白AI结构与功能研究进展J.国外医学分子生物学分册，2002, 24(1): 62-645Davidson WS, William WM, Ha
