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1、毕业论文开题报告生物工程梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫(Neobenedenia melleni)隶属单殖目、分室科、新贝尼登虫属, 在世界范围内广泛分布, 它主要寄生于重要海水养殖鱼类 , 如大黄鱼、 鮸鱼、石斑鱼、真鲷、花鲈 和牙鲆等鱼类体表、鳍和鳃丝等部位。虫体破坏宿主黏液组织, 吸取宿主的血液或吞食体表组织, 引起宿主皮肤搔痒而不停摩擦养殖网箱, 进而导致皮肤溃疡糜烂和体表组织大面积创伤脱落, 病鱼烦躁不安, 食欲降低、厌食或拒食, 容易因衰竭而死亡。近年来, 由于养殖生态环境变化及高密度养殖等原因, 该病害在我国浙江、福建和广东沿海一带重要
2、海水养殖地区频繁爆发, 鱼群自然感染率平均为52.14%, 最高感染率达 100%, 严重地影响我国沿海水产养殖业的发展。因此，梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗具有重要意义。组织蛋白酶B具有广谱的蛋白水解活性，活性中心含有巯基，可以降解血红蛋白、血清蛋白、卵黄磷蛋白、层粘蛋白、纤维连接蛋白和型胶原等细胞外基质成分。血吸虫的肠道内存在组织蛋白酶B，可以为其提供营养。梅氏新贝尼登虫也应该有类似的特性。目前，利用植物基因工程技术已经克隆了水稻、小麦、玉米等l5种不同来源的蛋白酶抑制剂cDNA，并通过基因枪或农杆菌介导等转化途径转人不同植物，其中大部分均获得了对昆虫具有明显抗性的转基因植株，解决了因大量使
3、用化学药剂控制害虫而造成的环境污染问题。这梅氏新贝尼登虫病的预防有很好的指导和借鉴意义。本研究目的旨在为梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗提供科学理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容：本实验主要是提取梅氏新贝尼登虫总RNA，获得梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B cDNA序列，并进行序列分析及进化树构建。拟解决的问题：梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B序列分析。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法 1. 实验动物 2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼(Pseudosciaena crocea)体表分离梅氏新贝尼登虫成虫，经系统寄生虫学
4、的鉴定，暂养于海水中至肠道内含物排空后，用无菌双蒸水反复冲洗虫体后置于Eppendoff管中，-70 C冰箱保存备用。 2.总RNA提取 利用RNAiso试剂提取梅氏新贝尼登虫组织总RNA： (1)将100 mg -70保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1 ml RNAiso组织(以下为加入1 ml Trizol试剂标准)。 (2)研磨后转入1.5 ml Eppendorf管中，剧烈振荡混匀，室温放置5 min。4 ， 12 000rpm离心5 min。 (3)取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15 s，充分混匀，室温放置2-3 min。4 ，12 000 rpm离心1
5、0 min。 (4)底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管(注意不要吸入蛋白层)，加入0.5 ml氯仿于上清，振荡混匀，室温放置2-3 min。4 ，12 000 rpm离心10 min。 (5)将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min。4 12 000 rpm离心10 min，去上清。 (6)加入DEPC水配制的体积分数75 乙醇1 ml，振摇，洗涤沉淀。4 12 000 rpm离心5 min。重复步骤(6)一次，以彻底将盐份除净。 (7)去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意：所有待用的非Tris的试剂用0.1
6、 % DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用0.1 % DEPC水处理过夜后121 高压灭菌20 min。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA降解。 (8)RNA样品OD值检测。取1 l RNA溶液加入到69 l DEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230 nm、260 nm和280 nm的OD值。 RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000(g/l) 去除蛋白指标：OD260/OD2801.8 去除盐分指标：OD260/OD2302.0 (9)RNA电泳检测。取5 l RNA样品加4 l DEPC处理水和1 l 10Buffer凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳
7、。 (10)mRNA纯化采用Oligotex-dT30进行纯化。 3. 构建寄生虫cDNA文库构建 实验采用的载体为pBluescript II SK (+)，根据选择的EcoRI和XhoI酶切位点和锚定引物。 3.1 cDNA第一链的合成 （1）模板RNA（Poly(A)+ RNA）5 .00g中加入不含RNA酶的灭菌水，使其总量达到10.8l。 （2）65加热5分钟后，冰中放置5分钟（冷却)。 （3）在微量离心管中配制下列反应液。试剂体积/l51st Strand Synthesis Buffer1st Strand dNTP MixtureRNase Inhibitor (20 U/l)
8、Oligo (dT)18 Anchor Primer (1g /l)4.0 1.2 1.0 2.0 （4）向(3)的反应液里加入2的热处理后的Poly(A)+ RNA溶液（5g），轻轻混匀。 （5）室温放置10分钟后，加入Reverse Transcriptae（M-MLV)1.0l（全量为20l)，轻轻混匀。 （6）42反应1小时。 （7）反应结束后置于冰中冷却2分钟。 3.2 cDNA第二链的合成（1） 在cDNA第一链合成液（20l）中按下列顺序加入反应试剂，进行2nd Strand cDNA的合成反应（反应液总量为146l)。试剂体积/l灭菌DEPC水52nd Strand Synth
9、esis Buffer2nd Strand dNTP MixtureRNase-free H2OE.coli RNase H/E.coli DNA Ligase MixtureE.coli DNA Polymerase I总体积可变30 4.5 87.5 2 2146 （2）用移液枪轻轻混匀后16反应2小时。（3）70加热10分钟后，室温放置5分钟。（4）加入4l的T4 DNA Polymerase后，轻轻搅拌。（5）37反应10分钟。（6）向2nd Strand cDNA合成反应液（150l）中加入等量（150l）的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）溶液。Vortex搅拌510秒钟。（7）
10、室温下15,000 rpm离心5分种，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中(注意切勿取出中间层)。（8）向水相中加入等量（150l）的氯仿/异戊醇（24：1）溶液，Vortex搅拌510秒钟。（9）在室温下15,000 rpm离心5分钟，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中。（10）加入1/10量（15l）的3 M Sodium Acetate(pH5.2)、4l 的Dr. GenTLE Precipitation Carrier、22.5倍量的100%乙醇。（11）均匀混合后立即进行15,000 rpm、30分钟的离心(室温下)。（12）除去上
11、清后用70%的乙醇清洗。（13）干燥沉淀后，用12.5l的不含RNA酶的灭菌水溶解沉淀。3.3 适配体连接(Adaptor Ligation)向上述双链cDNA溶液12.5l中加入下列试剂，全量20l。试剂体积/l灭菌DEPC水10T4 DNA Ligase BufferEcoR I-Sma I Adaptor (0.4 g/l)T4 DNA Ligase (350 U/l)总体积可变2 3.5 2 20(2) 轻轻混匀后，8过夜反应（16小时以上)。(3) 70保温30分钟后，室温放置5分钟。(4) 4下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4下12000g离心5分
12、钟。3.4 限制酶Xho I 酶切反应(1) 向Adaptor Ligation溶液20l中加入下列试剂，全量50l。试剂体积/l灭菌DEPC水Xho I SupplementXho I (50 U/l)总体积可变27 3 50轻轻混匀后，37反应3小时。3.5 使用Spin Column除去短链cDNA以下的Column处理可以除去400 bp以下的短链cDNA。Spin Column的准备:（1）反复上下颠倒悬浊Column内的Gel。（2）先取下上盖后，慢慢取下下盖，Column上下盖不要丢弃。（3）让Column内的Buffer自然流出（大约需要15分钟)。（4）安装下盖，向Colum
13、n中加入2 ml的TE Buffer后再盖上盖，反复上下颠倒悬浊Gel。（5）重复上述操作(2)(4)。（6）取下Column的上下盖，让Column内的Buffer自然流出。（7）将去盖的1.5 ml Microtube放置于FALCON Tube中，然后将Spin Column插入FALCON Tube中，将Column的下端安装于FALCON Tube中的1.5 ml Microtube内2，400 g离心2分钟。（8）丢弃FALCON Tube中的1.5 ml Microtube，向FALCON Tube中放入新的去盖的1.5 ml Microtube，再将Spin Column的下端
14、安装于FALCON Tube中的1.5 ml Microtube内。3.6 短链cDNA的除去（1）向Xho I 酶切溶液（50l）中加入下列试剂，充分混合。试剂体积/lTE BuffertRNA (10g/l)40 1 （2）将上述(1)的溶液向操作1中准备好的Spin Column中添加。请注意要添加在Column中的Gel表面的中央位置，每次添加约10l，分数次慢慢添加。（3）400 g离心2分钟。（4）Column洗脱液约100l转移至新的1.5 ml Microtube中，加入等量（100l）的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24 ：1）溶液，剧烈振荡混匀。（5）室温下15,000 rpm
15、离心5分钟，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中(注意切勿取出中间层)。（6）加入等量（100l）的氯仿/异戊醇（24 ：1）溶液，剧烈振荡混匀。（7）室温下15,000 rpm离心5分钟，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中。（8）加入1/10量（10l）的Sodium Acetate（pH5.2)、4l 的Dr. GenTLE Precipitation Carrier，22.5倍量的100%乙醇，充分混匀。（9）室温下15,000 rpm离心30分钟，除去上清，再用70%乙醇清洗沉淀。（10）干燥沉淀后用15l的RNase-free H2O溶解沉淀。3.7 连接到特定质粒载体载体结合反应配制下列Lig
