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1、毕业论文开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析一、选题的背景与意义：梅氏新贝尼登虫(Neobenedenia melleni，在日本，又名妃新贝尼登虫)是单殖目、分室科、新贝尼登虫属生物，世界上广为分布，在我国，广泛寄生于南方海水网箱养殖的名贵经济鱼类如大黄鱼、高体鰤、石斑鱼和鲷科鱼类的体表、眼眶或鼻腔等处。温度较高时，此寄生虫快速繁殖生长，易使上述感染对象患上夏秋季综合症，鱼类受感染的数量和程度都很大，受到感染的鱼极为难受，不停游动或擦网，寄生虫会破坏鱼类的表面粘液组织，诱发细菌和寄生纤毛虫感染，从而导致体表导致渔区网箱养殖鱼类大批死亡。特别是近年来频繁出现在我国东南沿
2、海一带的新贝尼登虫病，其带来的影响十分严重，不仅会危及到我国东南沿海水产养殖业的发展，同时，当地大量鱼类的受害会间接导致与之相关的生物圈发生巨大的变化，甚至有可能导致生态失衡。热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)又称为应激蛋白，是在细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应激蛋白质。它是生物细胞在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。目前已发现在环境胁迫因子(如高温、重金属和微生物感染等)的刺激下，其表达量显著增加。许多热休克蛋白具有分子伴侣的性质，因此HSP是一些在进化上非常保守的蛋白质家
3、族。依蛋白质分子大小，可以将热休克蛋白分为五类，即HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白smHSP。HSP70蛋白质家族是其中功能上较广的一种，也是被研究的最为深入的一种HSP蛋白。它不仅能够在热胁迫下表达，而且几乎是所有活体细胞中的重要成分。HSP70家族作为分子伴侣在许多生物学过程中起到了重要作用。因此，研究HSP70家族及其系统的功能结构十分重要。由于HSP在进化过程中的高度保守性，作为一种有效的分子标记，不少学者通过HSP序列分析研究分子流行病和系统进化之间的关系。本课题通过提取梅氏新贝尼登虫的RNA，使用PCR技术获取其HSP70序列，并分析其表达和功能
4、表征，从而研究不同发育阶段梅氏新贝尼登虫的HSP70的表达，为进一步探究HSP70在动物体内的功能和防治此类病虫害的方法提供理论基础，同时构建出来的进化树可以用于比较分析不同物种的HSP70氨基酸序列特征，以期为这些鱼类的抗逆、应激效应的深入研究提供依据。二、本课题研究的内容与拟解决的主要问题：研究的内容：本课题主要研究的是1)梅氏新贝尼登虫成虫、虫卵和钩毛蚴三个发育阶段样品的获得和保存；2)提取各个发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA；3)通过随机测序方法得到HSP70的基因序列；4)对获得的HSP70序列进行分析，而后进行进化树的构建、分析；5)采用荧光定量PCR，检测三个不同发育阶段的梅氏新贝
5、尼登虫的HSP70的表达差异。拟解决的问题：1)获取不同发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA 2)获得梅氏新贝尼登虫的HSP70的cDNA序列 3)梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析及进化树分析三、 研究的方法与技术路线：研究方法：1)梅氏新贝尼登虫样品的收集本次课题中的实验用虫采自宁波象山黄避岙三个发育阶段的虫体：成虫：采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，咸淡水浸泡病鱼后，用镊子小心取下体表成虫，暂养于过滤海水中至肠道内含物排空，过滤海水冲洗虫体粘液后置于Eppendoff管中，液氮速冻，-70 C冰箱保存备用。虫卵：采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水
6、族箱，回流过滤器过夜抽滤，抽滤物经镜检观察分离出虫卵，过滤海水浸洗后置于Eppendoff管中，液氮速冻，-70 C冰箱保存备用。钩毛蚴：将上述方法收集的虫卵放入盛有新鲜过滤海水的培养皿中，置于25人工智能气候箱中培养，每天镜检观察虫卵发育情况并更换新鲜过滤海水，约46天钩毛蚴逸出后收集于Eppendoff管中，液氮速冻，-70 C冰箱保存备用。2） RNA抽提并纯化：从已采集的样本中提取各发育阶段的RNA利用RNAiso试剂提取上述样本中提取RNA：(1)将100 mg -70保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1 ml RNAiso组织(以下为加入1 ml Trizol试剂标准)。(2)
7、研磨后转入1.5 ml Eppendorf管中，剧烈振荡混匀，室温放置5 min。4 ， 12 000rpm离心5 min。(3)取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15 s，充分混匀，室温放置2-3 min。4 ， 12 000 rpm离心10 min。(4)底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管(注意不要吸入蛋白层)，加入0.5 ml氯仿于上清，振荡混匀，室温放置2-3 min。4 ，12 000 rpm离心10 min。(5)将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min。4 12 000 rpm离
8、心10 min，去上清。(6)加入DEPC水配制的体积分数75 乙醇1 ml，振摇，洗涤沉淀。4 12 000 rpm离心5 min。重复步骤(6)一次，以彻底将盐份除净。(7)去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意：所有待用的非Tris的试剂用0.1 % DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用0.1 % DEPC水处理过夜后121 高压灭菌20 min。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA降解。(8)RNA样品OD值检测。取1 l RNA溶液加入到69 l DEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230 nm、260 nm和280 nm的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释
9、倍数40/1000(g/l)去除蛋白指标：OD260/OD2801.8去除盐分指标：OD260/OD2302.0(9)RNA电泳检测。取5 l RNA样品加4 l DEPC处理水和1 l 10Buffer凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。(10)mRNA纯化采用Oligotex-dT30进行纯化。3)基因克隆与随机测序在提取梅氏新贝尼登虫RNA后，用Oligotex-dT30纯化mRNA，以其为模板，采用cDNA Library Construction Kit构建梅氏新贝尼登虫cDNA文库，具体方法参照厂家说明。随机挑选一些克隆，部分测序并经BLASTP（http:/www.ncbi
10、.nlm.nih.gov/BLAST/）分析，测通与已知物种HSP70基因序列相似的插入片段克隆。4)荧光定量PCR采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)来检测梅氏新贝尼登虫HSP70的表达差异。(1)利用已提取的RNA序列，进行第一链cDNA合成。25L PCR的反应体系包括SYBR Premix Ex Taq(2)缓冲液12.5 L，引物各1L，模板0.5 L。扩增反应在Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪上进行，程序为94 180s(1个循环)(2)进入扩增阶段，共40个循环，每一循环包括：9
11、4 30 s，58 30 s，72 30 s。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是94 30 s，72 60 s，95 30 s(1个循环)。为保证PCR结果的准确性，每一个样品重复分析3次，包括目标基因(hepcidin)和看家基因(-actin)。(3)荧光定量的结果采用仪器自带程序MxPro 3.2读取。(4)根据Livak & Schmittgen(2001)提出的相对标准曲线法2-Ct对相对定量的结果进行分析，获得梅氏新贝尼登虫HSP70基因mRNA的相对表达量。HSP70基因表达的差异用SPSS软件(13.0)中的单因素方差分析法(One-way ANO
12、VA)进行分析，以P 0.05为显著性差异。5)序列分析与进化树构建同源比对使用Blast软件(来自于NCBI官网上的BLAST分析系统)；信号肽序列预测使用SignalP 3.0系统(源于http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；多重序列比对使用ClustalW程序；系统进化树构建采用MEGA 4.0(Tamura et al, 2007)技术路线：(见下页)2）将用于产卵的成虫置于水盆中过夜。第二天，成虫产下虫卵，用于收集RNA的部分用液氮保存，其余的虫卵用于孵化3）将余下虫卵置于25的环境孵化（6天）。收集孵化出的钩毛蚴，并用液氮保存基因克隆,并通过
13、随机测序方法获得HSP70基因序列HSP70 cDNA序列梅氏新贝尼登虫不同发育阶段样本的采集提取三个发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA1）用刀从鱼体上采集成虫，用于收集RNA的部分用液氮保存，其余用于产卵的则放入水盆中数据整理总结，撰写并完成论文荧光定量PCR1）第一cDNA链合成2）扩增阶段（40个循环）3）用MxPro3.2读取荧光定量的结果获得HSP70基因mRNA的相对表达量序列分析和进化树构建HSP70 cDNA序列4)检测不同发育阶段的梅氏新贝尼登虫HSP70的表达差异HSP70 cDNA序列四、研究的总体安排与进度第七学期：2010年10月 毕业论文选题,而后开始收集有关课题的资料
14、，并与老师交流， 了解课题的目的、意义以及方法2010年11月-12月 根据已经整理的材料，撰写文献综述、任务书和开题报告，并进 入实验室了解实验相关细节2010年12 月 进行开题报告及文献综述，修改并完善相关材料，为进一步的实 验做好准备2010年12月-2011年3月 进行实验及数据的收集、统计：（正式实验：第一阶段样本收集: 2010年7-8月第二阶段RNA提取： 2010年12月提取三个发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA第三阶段获得序列：2010年3月通过随机测序获得HSP70基因序列，进而进行序列分析和进化树构建第四阶段表达分析：2010年3月通过荧光定量PCR检测不同发育阶段的HSP
15、70的表达差异）第八学期：2011年3月-2011年4月 对实验数据进行整理、分析：发育各阶段的HSP70 mRNA表达量进行分析，以及使用SPSS软件分析数据和显著差异2011年3月-2011年4月 完成2篇英文翻译，论文的撰写和提交2011年5月 完成毕业论文的答辩五、主要参考文献：1 杨文川, 李立伟, 石磊等. 妃新本尼登虫(单殖目: 多室科)的发育J. 动物学报, 2002,48(1): 75-792 杨丽华. 大黄鱼的病害防治J. 渔业致富指南, 2002, 4: 543 杨文川, 李立伟, 石磊等. 福建海水养殖鱼类寄生贝尼登虫病原学研究J. 台湾海峡, 2001, 20(2): 205-2094 Ogawa K.,
