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1、1,一、获得纯培养的方法,纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.,2,首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物.,液体稀释法,3,平板划线分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,4,平板涂布分离法（Spread Plate）,简单易行，但易造
2、成机械损伤,5,第二节 微生物的生长规律,6,同步生长：同步生长即是微生物群体中各个细胞处于同一发育阶段，群体和个体行为一致，所有的细胞都能同时分裂。 同步细胞:进行同步分裂的细胞称为同步细胞。,一、微生物的个体生长和同步生长,获得同步生长的方法 ： 调整生理条件诱导：控制环境条件如温度、光线和 添加新鲜培养基 机械法（又称选择法）：利用物理方法从不同步的细菌群体中选择，主要有过滤分离法和梯度离心法,同步细胞是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,7,将少量单细胞的纯培养，接种到一新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数
3、为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,二.单细胞微生物的群体生长曲线,8,将一定量的细菌接种到适宜的液体培养基中培养，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数的对数为纵座标作图，得到的一条定量反映细菌在液体培养基上生长规律的曲线。,生长曲线的定义,根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。,二.单细胞微生物的群体生长曲线,9,典型的生长曲线（Growth curve）,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。,典型的生长曲线（Growth curve）,10,又叫适应期、
4、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间，细胞数目不增加，后期曲线略有上升。 2.特点：分裂迟缓，代谢活跃 生长速率：常数为 0 细胞形态：变大或增长 细胞内物质：RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性强 合成代谢：活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶 对外界不良条件反应：敏感（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物） 3.原因：调整代谢，适应新的环境条件，如合成新的酶，积累必要的中间产物,.延滞期（lag phase）,11,菌种 ： 繁殖速度快的，延迟期较短； 菌龄 ： 对数生长期的菌种，延迟期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：接种量增大，缩短甚至消
5、除延迟期； （发酵工业上一般采用1/10的接种量）； 培养基成分： 营养成分丰富的天然培养基上，延滞期短；培养基成分变化大时，延滞期加长。 发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素：,12,认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：,在发酵工业上需设法缩短延迟期（加速发酵周期，提高设备利用率） 采取的缩短措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种,13,.对数期（logarithmic phase）,又称：指数期 特点： 细胞数目以几何级数增加 （对数与
6、时间呈直线关系） 生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行平衡生长：菌体大小、形态、生理特征等比较一致 代谢最旺盛 细胞对理化因素较敏感,此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳种子； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,应用：,14,影响因素：,（1）菌种：不同菌种的代时差别大 E.coli 17 分，结核杆菌 792932分 （2）营养成分：丰富时，生长快 （3）营养物浓度：影响生长速度及生长量。,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物，称为生长限制因子。,（4）培养
7、温度 如：大肠杆菌 10 代时860分， 15 代时120 分， 40 代时17.5分,15,单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（eneration time, G ），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时也称为倍增时间。,右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。,16,. 稳定期（stationary phase）,1、特点： 生长速率常数R=0，即新繁殖的细
8、胞数与衰亡相等，这时菌体产量达到了最高点 细胞开始贮存各种储藏物：异染颗粒等 芽孢开始形成， 次级代谢产物开始合成。,又称：恒定期或最高生长期,产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 物化条件（pH、氧化还原势等）不合适; 菌体量达到一定产量。,17,应用意义： 1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度,2）稳定期初期是收获菌体或与菌体生长相平行的代谢产物的最佳时期，如SCP、乳酸。 稳定期是积累代谢产物时期,18,. 衰亡期（
9、decline phase）,特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。 产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,19,3.微生物生长与代谢产物形成的关系,微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：,初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初
10、级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；,次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。,20,指数生长可以用下式表示： b = B2n B, b 和 t 可由试验获得， n 可通过 上式计算得出，将等式两侧取对数 重排后得： lgb = lgB + nlg2 lgb - lgB lgb - lgB lg2 0.301,式中： B 为起始始细胞数目， b 为指数生长某个时刻 t 时的细胞数目， n 为世代数,n =,=,指数生长
11、,21,例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ B ），经4h （ t ）后增加到49，000，000（ b ）， 这样， n (lg4.9107lg1.2104）0.30112,借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G， G t / n 在本例中， G 460 / 12 20min 该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。,22,代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。 代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为13h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一
12、些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。,23,一些细菌的代时,菌名培养基培养温度 代时 E. coli（大肠杆菌） 肉汤 3717min E. coli 牛奶 3712.5 Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶 371618 E. aerogenes 组合 372944 B. Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018 B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3 Lactobacillus acidophil
13、us（嗜酸乳杆菌）牛奶376687 Streptococcus lactis（乳酸链球菌）牛奶3726 S. lactis乳糖肉汤3748 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖2534446 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合3779293 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）组合271200,24,不同温度下的代时,温度对微生物的代时有明显影响： E. Coli 在不同温度下的代时 温度（）代时（分）温度（）代时（分） 108603522 151203717 20904017.5 25404520 302947.577,
