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1、凯氏定氮法测定蛋白质含量,1,2,171名婴儿为何变成“大头娃娃”,2008年当奥运圣火熄灭以后，我国各地的新闻版面相继都在大篇幅的报道关于“大头娃娃”的新闻。 根据医院的诊断，这些婴儿所患的都是营养不良综合征，而扼杀这些幼小生命的“元凶”，正是蛋白质等营养元素指标严重低于国家标准的劣质婴儿奶粉。,3,导致“大头娃娃”出现的一个原因就是我们在食品蛋白质检验过程中存在的问题：通常我们利用凯氏定氮法测定食品中的氮含量，再利用以下公式计算出食品中的蛋白质含量,凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确，操作较简便的方法之一。虽然食品样品中常常混有少量非蛋白质含氮有机物，影响测量结果，但考虑到其低成本、易普
2、及等优点更适合我国国情，所以，凯氏定氮法也是目前我国对食品中蛋白质含量的标准检测手段。,4,实验原理 :,1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4,反应式为： H2SO4=SO2+H2O+O R. CH.COOH+O=R.CO.COOH+NH3 NH3 R.CO.COOH+O=nCO2+mH2O 2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4,2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。,反应式为: 2NH4+OH-=NH3+H2O NH3+H3BO3=NH4+H2BO3-,凯氏定氮法原理介绍：,5,3. 再用已知浓度的
3、HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。,反应式为： H2BO3-+H+=H3BO3,实验试剂 HCI标准溶液（0.05 mol.L-1 ） H3BO3溶液(2%) H2SO4(浓) NaOH溶液(50%) K2SO4(固体) CuSO4.5H2O(固体) 甲基红次甲基蓝混合指示剂或甲基红溴甲酚绿混合指示剂,6,实验仪器：,凯氏烧瓶（100ml）:1个 凯氏定氮装置 移液管(10ml): 1支 酸式滴定管(10ml): 1支,凯氏定氮装置图,1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套
4、 9.反应管 10.蒸汽发生瓶,7,实验步骤：,一、 消化液的制取 准确称取奶粉样品0.5g，置于凯氏烧瓶内，加入89gK2SO4,0.4gCuSO4.5H2O及15ml浓H2SO4，加数粒玻璃珠，缓慢加热，并小心地尽量减少泡沫产生，防止溶液外溅，使样品全部浸于H2SO4内。样品中泡沫消失后，即加大火力至溶液澄清，再继续加热约1h，冷却至室温。沿瓶壁加入50ml纯水，溶解盐类，冷却，转入100ml容量瓶中，以纯水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。,二、NH3的固定 1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中加数滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石,8,在整个蒸馏过程中需
5、保持此液为橙红色，否则补加H2SO4。接收液为20ml 2%的H3BO4溶液，其中加2滴混合指示剂，接收时使装置的冷凝管下口浸入吸收液的液面之下。,2、移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用少量水冲洗进样口，然后加入10ml 50% NaOH溶液于反应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开始回流记时，蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏，用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸收液内。,三、NH3的标定 用0.05mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。,四、蛋白质含量的计算,蛋白质（%）=总氮量（%）6.25,9,凯氏定氮法存在的问题,（1）这种方法在操作上并不是一
6、种非常理想的检测方法，但目前仍在使用的原因在于尚未有另外一种检测方法来代替这种方法。这种方法耗时，要花好几个小时才能做一个样品，而且用的化学试剂也是非常危险，需要用硫酸加热到400。 （2）凯氏定氮法是测量总氮含量，根据总氮含量，通过换算，再转化成蛋白质含量。实践证明已经引起许多的问题。因为除蛋白质以外的含氮化合物，在凯氏定氮过程中，被同样消化成(NH4)2SO4，造成蛋白值虚高，我们统称这些化合物为非蛋白氮/或假蛋白氮（NPN）。,10,四解决凯氏定氮法弊端 解决问题的根本方法，是直接测试食品中的真蛋白质含量。因为，如果能够一次直接测定食品中真蛋白质含量，以真蛋白质含量为标准，那么就堵住了市
7、场监管上的漏洞，使伪劣产品无所遁形。因此添加假蛋白质物质，如三聚氰胺等就毫无意义了。区别蛋白质与NPN的意义在于可以获得真实准确的蛋白质含量。从根本上解决了问题，厂商只能提供达标产品。这对需要进行蛋白质检测行业如食品、饲料及蛋白研究和管理领域具有重要的价值。,11,在市场上有一种美国培安 CEM SPRINT真蛋白质分析仪，它是快速测量乳制品等食品中真蛋白质含量的一项新技术。它采用的是运用在生物科学领域的iTAG“氨基酸分子标签”技术，这项技术可以让我们给蛋白质贴上“标签”，提供一种在样品中直接测量真蛋白质含量的手段。,前沿技术：,12,美国培安 CEM SPRINT真蛋白质分析仪的优势：,第
8、一，它是一种直接测量真蛋白质的方法，而非测总氮的方法，总氮里的氮不一定是蛋白质里的氮。 第二，由于它直接测量真蛋白质，因此，这种检测方法更加准确，蛋白测定范围：0.01-99.99%，样品范围不受性状局限。 第三，它的测定速度非常快，操作也简便，利用一次性的样品杯，操作人员只需称量好样品，放入仪器中，按下操作键，2分钟后便可以得到测量结果，相比凯氏定氮在速度上有很大的提高。 第五，安全，无需处理任何危险的试剂、高温或其它非正常条件，就在普通实验室或其它地方就可以操作这套仪器。而且，它是非常绿色技术的产品，没有任何有毒有害物质产生。目前的凯氏定氮方法会产生带有硫酸、金属催化剂等必须废弃掉的有毒气体。,13,谢谢观看！,14,
