Chapter 3 核酸化学演示课件

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1、1,第三章核酸化学,Nucleic Acid chemistry,2,核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,3,第一节 核酸是遗传物质的载体,一、核酸的研究发现史 1868年，F. Miescher从细胞核中分离得到一种含磷量很高酸性物质，即现在被称为核酸的物质。,4,1928年，F. Griffith的转换转化实验,or,and,可分离,5,1952年， Hershey、Chase T2噬菌体：32P和35S分别标记核酸和蛋白 1953年，Watson、Crick DNA双螺旋模型 198

2、1年，Cech 核酶（Ribozyme）,6,98核中（染色体中） 真核 线粒体（mDNA） 核外 叶绿体（ctDNA） DNA 拟核 原核 核外：质粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,二、核酸的种类和分布,核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid （DNA） 核糖核酸 ribonucleic acid（RNA）,7,RNA主要存在于细胞质中,tRNA (transfer RNA) rRNA (ribosomal RNA)（真核与原核的区别） mRNA (messeger RNA) （真核与原核的区别） 其它 RNA病毒：SARS、TSV,三、分子生物学的

3、中心法则,8,第二节 核酸的基本化学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,元素组成： C H O N P,核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,9,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,10,二、碱基,1. 嘌呤碱（Purine bases）,11,2. 嘧啶碱（Pyrimidine bases）,CH3,12,核酸中

4、也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,13,三、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 (糖苷 P19) 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,14,假尿苷（） 次黄苷（肌苷）I 黄嘌呤核苷 X 二氢尿嘧啶核苷 DHU 取代核苷的表示方式 7-甲基鸟苷 m7G,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,15,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,16,五、核苷酸衍生物,1. 继续磷酸化,17,2.环化磷酸化,cAMP,cGMP,3. 辅酶 NAD、NADP、FAD,18,六

5、、多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,19,20,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示） 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。 注意：核苷酸链的方向与二酯键的方向相反,多聚核苷酸的表示方式：1.竖线式：P4822.文字式：,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,21,第三节 DNA的结构,一、DNA的一级结构

6、 脱氧核糖核酸的排列顺序 可以用碱基排列顺序表示 连接键：3，5-磷酸二酯键 磷酸与戊糖依次相连形成主链骨架 碱基形成侧链 多核苷酸链均有5-末端和3-末端 DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,22,2. 基因与基因组,基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。,23,基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。 包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒DNA）,各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小,24,3. 原核生物基因组特

7、点 重复序列少，多位编码区 多为操纵子形式组织 有重叠基因存在,真核生物基因组特点 以染色体存在 重复序列多,基因组计划 人类基因组计划（Human Genome Project， HGP ）： 19902002 酵母基因组计划 （YGP）：1989-1996 大肠杆菌（E.Coli）：1997,25,negative control,26,二、DNA的二级结构,（一） Chargaff 规律 1950年,（1）所有生物的DNA中，A=T，G=C，A+C=G+T， 且A+G=C+T。 （2） DNA的碱基组成具有种的特异性。 （3） DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。 （4） 年龄、营养状

8、况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。,27,(二) DNA的双螺旋模型,1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,28,DNA双螺旋模型要点,B型结构 a. 两条链反向平行，右手螺旋; b. 碱基在内（AT，GC），碱 基平面垂直于螺旋轴, 戊糖环在外，平行于螺轴； c. 双螺旋每转一周为10碱基对（bp），上 升3.4nm; d. 氢键维系两链的结合； e. 碱基自由排列。,29,（1）

9、B-DNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA 右手双螺旋 每圈螺旋10.4个碱基对 螺距：3.22nm （2） A-DNA 右手双螺旋，外形粗短。 RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。 （3）Z-DNA 左手螺旋，外形细长。 天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,30,双螺旋DNA的结构参数,稳定双螺旋的力 氢键 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力） 离子键等 则：DNA变性剂（热、pH、脲/酰胺、有机溶剂）,31,三股螺旋DNA K. Hoogsteen 1963,通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合： oligo(Py) :

10、oligo(Pu)oligo(Py/Pu) 第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤,32,第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对。,T= A : A , CG ： C+ T = A : T CG ： G,33,DNA的存在形式,34,二、DNA的三级结构,DNA三级结构：指DNA双螺旋的进一步扭曲与折叠形成的特定构象，包括三方面内容（P490） 原核 双链环状DNA（dcDNA） 病毒 单链环状DNA（scDNA） 单链线性DNA（ssDNA） 负超螺旋 几个参数： 连环数：指双链的互绕数，L（linking number） 扭转数：指螺旋圈数，T（twist

11、ing number） 超螺旋数：即缠绕数，W（writhing number） L = T + W 拓扑异构酶：I（L01）、II（ L0-2 ）,35,36,真核 双链线性DNA（dsDNA）：P495,37,38,第四节 RNA的结构与功能,一、结构特点 碱基组成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解 多为单链结构，少数局部形成螺旋 分子较小 分类 mRNA（hnRNA 核不均一RNA） tRNA rRNA （snRNA/asRNA） 少数RNA病毒,39,二、tRNA,占RNA总量的15 一种氨基酸对应最少一种tRNA,分子量25000左右，大约由7090个

12、核苷酸组成。 分子中含有较多的修饰成分。 3-末端都具有CpCpAOH的结构。 三叶草形（二级结构）：1个臂、4个环,40,tRNA的三级结构,41,42,三、rRNA,占RNA总量的80,43,四、mRNA和hnRNA,占细胞总RNA的35,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构” ，5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为 “帽结构 ” 。P484,五、snRNA （small nucleic RNA 核小RNA） scRNA （small cytoplasmic RNA） asRNA （antisense RNA）,44,第五节 核酸的

13、性质,45,二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光,46,三、核酸的变性、复性与分子杂交,1. 变性 稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的一级结构(碱基顺序)保持不变。 变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素 pH（11.3或5.0） 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度 加热,4

14、7,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称熔解温度或熔点，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在82-95C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关，也与DNA的均一性和介质中离子强度有关。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,2. 热变性和Tm,48,3. 核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减

15、色效应。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度Tm25 复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/ 溶液离子强度,49,4.分子杂交,DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 Southern 杂交（Southern bloting） Northern 杂交（Northern bloting） Western 杂交 （Western bloting）,50,51,引物,引

16、物,* 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 * 引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性。,3,5,5,5,5. PCR技术,基因组,52,PCR原理图,3,3,3,变性、退火,延伸,变性、退火、延伸,3,53,四、核酸的序列测定,双脱氧链终止法（Sanger酶法）,54,本 章 小 结,核酸是遗传物质载体的证明和研究历史 核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号） DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定）、二级结构（ Watson Crick双螺旋模型、ZDNA）、结构维持的化学键 RNA结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能