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1、,一、实时荧光PCR平台简介 二、荧光PCR系列产品操作细节 三、荧光PCR异常结果分析,一、实时荧光PCR平台简介,传统PCR & 实时荧光PCR,实时荧光PCR 常用荧光标记,荧光染料 SYBR Green I Syto 9 荧光探针 TaqMan TaqMan-MGB,TaqMan水解探针作用机理,实时荧光PCR 实验原理,采用特异性引物，结合特异性的TaqMan荧光标记探针技术，通过荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测。,扩增曲线 四个阶段,基线 阈值 Ct值 【DNA】0,基线：扩增曲线的水平部分 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的 默认前15个循环信号作为荧光本底信号
2、,对数图谱,线性图谱,基线 阈值 Ct值 【DNA】0,默认阈值=基线（背景）信号标准偏差 10 缺省设置：3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值（进入指数期的最初阶段）,基线 阈值 Ct值 【DNA】0,Ct值：每个样本荧光信号到达设定域值时所经历的循环数,基线 阈值 Ct值 【DNA】0,每个样本的Ct值与该样本的起始拷贝数（【DNA】0）的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。,起点定量 & 终点定量,起始DNA量：样本中原有的量，更有意义； 终点DNA量：经PCR过程加工，不是研究所需要的数据； 起点定量误差小，终点定量误差大
3、。,二、荧光PCR系列产品操作细节,HPV系列产品,13种高危型HPV检测试剂盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68） 不分型,14种高危型HPV检测试剂盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68） 对HPV16、18分型,样本类型&采集方法,宫颈脱落细胞 用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞。 男性尿道标本 用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。 男女性疣体标本 既可以直接切下疣体
4、组织放进无菌玻璃管内，又可以用一次性注射器把疣体刺破后再用棉拭子反复擦拭病灶处脱落细胞置入无菌玻璃管，密闭送检。 特殊样本 TCT采集系统样本：可以使用，但可根据所剩细胞浓度 竞品采样系统样本：亚能、港龙等采样系统样本均可用，HC2采样系统要确保未经过处理方可使用,采样前注意事项,不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。 （可能会抑制PCR反应） 检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。 （可能会造成假阴性） （可能会抑制PCR反应） 检查前48小时不应有性生活。（可能会造成假阳性） 月经期不可采集标本。（防止血液过多，可能会抑制PCR反应） 注意避免交叉污染。（可能会造成假
5、阳性）,样本保存,样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱4存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。 一周后检测的标本应保存在-20 。,DNA提取,取800ul样本离心得沉淀 加入细胞裂解液50ul，煮沸10min 12000离心10min即可上机,若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀； 若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次； 血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次； 粘液多样本，取样时尽量去除粘液。,应注意防止爆盖： 金属浴可压重物（冰盒、冰袋等） 水浴应采用螺旋管盖的离心管 确保离心管质量合格,优点：简单、快捷、方便。 缺点：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂
6、类等PCR抑制剂。,针对男性样本或女性疣体样本（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致,DNA质量要求,匹基、达安等都是使用直接煮沸法提取的DNA， 可直接使用 使用过柱法试剂盒，比如QIAGENE提取的DNA，也可以使用,PCR试剂配制,按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装,对照设置,定性试验 每次试验都必须设置阴阳性对照 定量试验 个别医院要求定量结果，需增加标准品（105、106、107、108 copies） 标准品一般可以反复冻融3-4次，超过5次，则不建议使用 标准品置于-20中保存,操作注意事项,PCR试剂保存配制 PCR试剂应放于-20
7、避光保存 PCR试剂应避免反复冻融 试剂配制时不能佩戴有粉手套 PCR mix与Taq酶充分混匀 加模板时应避免吸到沉淀 漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较安全 切勿在PCR管上做标记，但应注意样本顺序 上机前应离心去除气泡 标准品加样时应尽量避免加样误差，影响标准曲线,仪器检测通道选择,STD系列产品,CT/NG/UU联合检测试剂盒 淋球菌核酸检测试剂盒 沙眼衣原体核酸检测试剂盒 解脲脲原体核酸检测试剂盒,样本类型&采集方法,宫颈脱落细胞 用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞。 泌尿生殖道标本 用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子
8、置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。,样本保存,样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱4存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。 一周后检测的标本应保存在-20 。 棉拭子样本应在真空管中保存，要操作前再加生理盐水/细胞保存液进行洗脱。,DNA提取,取800ul样本离心得沉淀 加入细胞裂解液50ul，煮沸10min 12000离心10min即可上机,若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀； 若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次； 血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次； 粘液多样本，取样时尽量去除粘液。,应注意防止爆盖： 金属浴可压重物（冰盒、冰袋等） 水浴应
9、采用螺旋管盖的离心管 确保离心管质量合格,优点：简单、快捷、方便。 缺点：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。,针对泌尿生殖道样本（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致,PCR试剂配制,按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装,对照设置,定性试验 每次试验都必须设置阴阳性对照 定量试验 个别医院要求定量结果，需增加标准品（105、106、107、108 copies） 标准品一般可以反复冻融3-4次，超过5次，则不建议使用 标准品置于-20中保存,操作注意事项,PCR试剂保存配制 PCR试剂应放于-20避光保存 PCR试剂应避免
10、反复冻融 试剂配制时不能佩戴有粉手套 PCR mix与Taq酶充分混匀 加模板时应避免吸到沉淀 漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较安全 切勿在PCR管上做标记，但应注意样本顺序 上机前应离心去除气泡 标准品加样时应尽量避免加样误差，影响标准曲线,仪器检测通道选择,乙肝病毒定量产品,对临床血清标本中的乙型肝炎病毒（HBV）核酸DNA的定量检测,样本类型&采集方法,血清样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于无菌收集管中，室温放置不超过4 h， 1500 rpm离心5 min，吸取血清转入1.5 ml离心管中备用。 血浆样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于含有EDTA作为抗凝剂的无
11、菌收集管中，室温放置不应超过4 h，1500 rpm离心5 min，吸取血浆转入1.5 ml离心管中备用,样本保存,样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱2-8存放，并在72h内检测 -20保存不超过3个月 -70下长期保存 应避免反复冻融,DNA提取,1）取200ul样本于1.5ml离心管中 （血清/血浆/阴阳质控品/阳性标准品)； 2）加入20ul蛋白酶K； 3）加入200ul溶液L，混匀，56温浴10-15min； 4）加入200ul无水乙醇，充分混匀； 5）将全部液体转移至带收集管的硅胶柱中； 6）10000rpm离心1min，弃废液； 7）加入500ul溶液W1（确保已加入乙
12、醇）； 8）10000rpm离心1min，弃废液； 9）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）； 10）10000rpm离心1min，弃废液； 11）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）； 12）10000rpm离心1min，弃废液； 13）空管离心，12000rpm离心3min，丢弃收集管； 14）将硅胶柱装入新1.5ml离心管中，开盖1-2min； 15）往硅胶柱中心加入60-200ul的TE，静置3-5min； 16）12000rpm离心2min，弃柱得DNA。,提取前，应将HBV内标加入到裂解液中溶液L：HBV内标=200 l：0.5l,温浴后，加样前应点动离心,乙醇可提取放于冰
13、箱，低温可提高DNA的沉降效率,样本管编号与硅胶柱编号应一一对应,TE可提前预热，但温度不宜过高，可提高DNA的洗脱效率,硅胶柱编号与新离心管编号应一一对应,PCR试剂配制,按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装,对照设置,定量试验 每次试验均需设置一个强阳性对照、一个临界阳性对照、一个阴性对照 加样顺序为待测样本DNA、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照、对照上清液、阳性工作标准品1-4 （5106 IU/ml、5105 IU/ml、5104 IU/ml、5103 IU/ml）,操作注意事项,PCR试剂保存配制 PCR试剂应放于-20避光保存 PCR试剂应避免反复冻融 试剂配制时不能佩
14、戴有粉手套 PCR mix与Taq酶/UNG酶充分混匀 加模板时应注意加样量的准确性，减少定量的操作误差 切勿在PCR管上做标记，但应注意样本顺序 上机前应离心去除气泡,仪器检测通道选择,整体操作流程,DNA提取,PCR试剂配制、加样,样本采集,结果分析,上机扩增,结果分析,设置基线（以ABI仪器为例） 若有Ct16的强阳性样本，将此样本定为强阳性，并将此样本从数据库中剔除，然后以3-15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct值；若该样本需进行定量，则将其稀释后再重新扩增 ； 若无Ct16的强阳性样本，应选3-15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct值。 设置阈值线 基线和阴性对照的上方，同
15、时保证在指数增长期内,整体扩增曲线观察 整体扩增曲线平滑 阴性对照、阳性对照结果正常 弱阳性样本拐点明显 每个样本的内质控曲线观察：若无内质控曲线，应观察是否有其他型别阳性曲线；均无曲线，则该样本扩增无效，需复查 若有标准曲线，两两标准曲线之间等距离，高低值标准品的Ct值是否在正常范围内，观察回归系数、斜率、截距等参数,结果分析,三、荧光PCR异常结果分析,扩增曲线 标准曲线 原始数据,常见故障排除,异常扩增曲线,基线设置是否正确 基线校正 基线开始值 基线终止值 阈值设置是否正确 设置在指数增长期 自动或手动设置,扩增曲线出现交叉,多引物、多探针反应体系中，每个类型的扩增效率不一致到导致 样
16、本本身的原因导致荧光曲线的差异,扩增曲线平台期低,样本浓度问题 引物二聚体或浓度问题,扩增曲线指数增长期异常,无指数增长期？ 指数增长期较短？,扩增曲线不光滑,样本信号值太弱，点与点之间的差距被放大 扩增时间开始较晚，定量不准确,扩增曲线呈直线上升,部分探针降解，降解的探针也会形成信号，但信号值比较低 加入的样本DNA含有较多的杂质,扩增曲线呈直线上升,基线的终点大于Ct值，其中包含部分指数增长期信号，导致标准偏差偏大，阈值过高 反应管内留有气泡，由于温度升高后导致气泡破裂，使荧光值突然降低,阴性对照产生较高荧光,PCR mix被污染 PCR管有杂质 反应过程探针降解,标准曲线线性关系不佳,稀释精度差 加样精度差 反应体系需优化 标准品降解,精密度差,加样误差：操作、移液器、反应液未混匀 体系配制
