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1、1,第四章 酶促反应动力学,2,第四章 酶促反应动力学,基本要求：,掌握简单催化反应动力学、有抑制的和酶失活反应动力学，掌握影响酶催化反应速率的因素，以及动力学参数的求取。,重点： 各种情况下的酶动力学方程。难点： 酶催化反应动力学机理方程的推导。,学时：6学时,3,4,第一节 酶促反应学的特点,5,第二节 均相酶促反应动力学,6,2.1 酶促反应动力学的基础,7,（一）反应速率及其测定,反应速率：单位时间内反应物或生成物浓度的改变量。,数学表示方法:,或,t,r,反应速率与时间的关系,8,（二）反应分子数和反应级数,1.反应分子数,反应分子数是在反应中真正相互作用的分子数目。,（1）单分子反
2、应,根据质量作用定律，单分子反应的动力学方程：,9,（2）双分子反应,根据质量作用定律，双分子反应的动力学方程：,10,2.反应级数,根据实验结果，整个化学反应反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应就是几级。,（1）一级反应,反应速率只与反应物的浓度的一次方成正比关系，为一级反应。,11,移项,积分,得,则,当,12,代入则,因而,t,k,一级反应lnc与时间关系,13,（2）二级反应,反应速率只与反应物的浓度的二次方成（或两种底物浓度的乘积） 正比关系，为二级反应。,当用a 、b分别代表反应物A和B的初始浓度，x表示反应时间t时已发生 反应的物质浓度，则有：,14,情况1：A和B的
3、初始浓度相同，则,移项积分,情况1：A和B的初始浓度不同，则,移项积分,k,t,15,（3）零级反应,与反应物的浓度无关，而受其它因素的影响，为,积分,x,t,k,16,2.2 酶促反应动力学方程式,（一）Michaelis-Menten 方程,基于快速平衡理论,方程推导三点假设(平衡假设 )： 与底物浓度S相比，酶的浓度E是很小的，因而可忽略由于生成中间复合物ES而消耗的底物。 不考虑这个逆反应的存在。若要忽略该反应的存在，则必须是产物P为零，换言之，该方程适用于反应的初始状态。 认为基元反应的反应速率最慢，为该反应速率的控制步骤，而这一反应速率最快，并很快达到平衡状态。,17,对酶催化反应
4、过程的机理，得到大量实验结果支持的是活性中间复合物学说，该学说认为酶催化反应至少包括两步，首先是底物S和酶E相结合形成中间复合物ES，然后该复合物分解成产物P，并释放出酶E。 例如：酶反应 其反应机理可表示为,18,根据化学动力学，反应速率通常以单位时间、单位反应体系中某一组分的变量来表示。对均相酶的催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。 反应的速率可表示为 rs：底物S的消耗速率（mol/Ls） rp：产物P生成速率（mol/Ls） v：反应体系的体积（L） ns、np：底物S和产物P的质量（mol） t：时间（s）,19,根据质量作用定律，P的生成速率可表示为： 速率控制步骤在反应动力学
5、中是一个重要的概念。在一个多步骤的反应体系中，其中反应速率最慢的一步称为速率的控制步骤，并且控制步骤的速率决定了该反应的速率。,20,根据上述假定（3），可列出 K S 为解离常数（mol/l） 反应体系中酶的总浓度 为,21,代入 得米氏方程或称MM方程 rp,max：P的最大生成速率 E0：酶的总浓度，亦为酶的初始浓度,22,Briggs和JBHaldane对上述第三点假设进行修正，提出了“拟稳态”假设。,（二）Michaelis-Menten 方程修正,第一步：,第二步：,ES,P,E,+,“拟稳态”假设,合成的ES=分解ES,23,认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高得多，中间复合
6、物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物的浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间而变化。,消去 得,km：米氏常数(mol/l),24,km与ks的关系为 由两种推导方法所得速率方程式形式基本相同，不同的是ks值代表反应的平衡常数，而km值称为米氏常数，它代表动态的平衡常数，表示实际的恒态时的浓率关系。 当 时，km值才接近于ks,25,米氏方程,酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响,26,对米氏方程的讨论： 当sKm时， ，属零级反应。 当sKm时， 。Km在数量上等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。,27,例4-1：有一均相酶催化反应，km值为210-3m
7、ol/l，当底物的初始浓度S0为110-5mol/l时，若反应进行1 min，则有2%的底物转化为产物。试求：（1）当反应进行了3 min，底物转化为产物的百分数是多少？此时底物和产物的浓度分别为多少？（2）当S0为110-6mol/l时，也反应了3 min，底物和产物的浓度又是多少？（3）最大反应速率rmax值为多少？,28,解：（1）根据题意， ，此时一般可认为按一级反应处理，其动力学方程可表示为：,mol/l,时,29,将已知数据代入上式中，求得 min-1 、 当 t=3min时，可以求得 mol/l xS=6 % mol/l,30,（2）当S0为110-6mol/l时，仍可视为一级反
8、应， t=3 min时，同样可求得 xS=6 % mol/l mol/l,31,3）据 得 mol/lmin,32,（1）米氏常数的意义 是酶的一个特性常数： 的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。 值随测定的底物浓度、反应的温度、pH及离子强度而改变。 根据km值可以推断酶和底物的亲和力。如果酶的专一性不高，可催化几种底物发生反应时，km值最小的就表示酶与这一底物的亲和力最大，反之，则最小。,（三）动力学参数的意义,33,根据km值，可以估计胞内基质浓度，如 是没有意义的。,34,若已知某个酶的Km值，就可以计算出在某一底物浓度时，其反应速率相当于Vmax的百分率。 Km值可以帮助推断某一
9、代谢反应的方向和途径。催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km不同。,35,Km可以帮助推断某一反应的方向和途径,乳酸脱氢酶,乳酸,丙酮酸脱氢酶,乙酰CoA,丙酮酸脱羧酶,乙醛,Km=1.7x10-5mol/L Km=1.3x10-3 mol/L Km=1.0 x10-3mol/L,丙酮酸,36,（2）Vmax和K3(Kcat)的意义,在一定的酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。 当s很大时， Vmax=K3E。Vmax与K3成线性关系，而直线的斜率为K3。 K3 表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数又叫转换数（简称TN)，通称催化常数（catalytic c
10、onstant, kcat). Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。,37,四、酶动力学图解法,要建立一个完整的动力学方程，必须通过动力学实验确定其动力学参数。对Michaelis-Menten方程，就是要确定rmax（或k+2）和km值。但直接应用Michaelis-Menten方程求取动力学参数所遇到的主要困难在于该方程为非线性方程。为此常将该方程加以线性化，通过作图法直接求取动力学参数。,38,1. 双倒数图解法（Lineweaver Burk图解）,双倒数,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,（一）图解法,39,-1/Km,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,40,
11、双倒数法应用广泛，但有两个缺点： 1、选用基质浓度不宜等量增加，否则在作图时，点都会集中在纵轴附近，难于正确作图。基质浓度以选用1.0、1.11、1.25、1.43、1.67、2.0、2.5、3.33，5和10等为宜，这样倒数值几乎是等量递增的。 2、反应速率测定稍有误差，其倒数值误差必将扩大，特别是在低浓度基质测定时，引起的误差更大，这样将影响直线斜率，影响 rmax及Km值 的测定。,41,2.v-v/S作图法(Eadie-Hofstee),将米氏方程改写：,42,3.Hanes-Woolf作图法,将米氏方程改写：,43,4.Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图,将
12、米氏方程改写：,44,（二）积分法,Henri Michaelis Menten积分方程式,有时在酶反应过程中，基质或产物的浓度可以测得，但反应初速度则难以测定。这时，就可选用积分方程式来测定酶的Vmax和Km。,45,式中：S为时间t时的基质浓度(S0-P),(S0-P)为时间t内所用去的基质浓度，也为时间t内所生成的产物浓度P。 上式可改写为 :,上式也是直线方程式，斜率为 ，直线交点于纵坐标 ，与横坐标 交于 。,46,例4-2：在pH=5.1，15时测得葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的初速度为：,S 103 (M) 5.55 8.33 11.11 13.69 16.66 22.22 27.77
13、 V 104 (M/min） 1.63 2.11 2.41 2.76 3.01 3.39 3.47,试从测定结果求这个酶反应的 Km 和Vmax 值。,47,解：从表S及V值，计算得 1/S 及 1/V 值，作图。从连接各点所得的直线，求得,48,第三节有抑制的酶催化反应动力学,在酶催化反应中，由于某些外源化合物的存在而使反应速率下降，这种物质称为抑制剂。 抑制作用分为可逆抑制与不可逆抑制两大类。 如果某种抑制可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的活性，则此类抑制称为可逆抑制，此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。 如果抑制剂与酶的基因成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类
14、抑制可使酶永久性地失活。例如重金属离子Hg2+”、Pb2+”等对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的抑制都是不可逆抑制。,49,根据产生抑制的机理不同,不可逆抑制,可逆抑制,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,50,1.竞争性抑制动力学,若在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质，该物质也能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制，该物质称为竞争性抑制剂。其主要特点是，抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。在琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是其竞争性抑制剂。,51,式中：I为抑制
15、剂；(EI)为非活性复方物。,52,底物的反应速率方程为 :,又：,53,经整理后可得,KI抑制剂的解离常数 （mol/l） KmI有竞争性抑制时的米氏常数（mol/l）,可以看出，竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变，rmax不受竞争性抑制剂的影响。由于有抑制剂的存在，须有较高的基质浓度，才能维持一定的rmax值。,54,竞争性抑制动力学的主要特点： 竞争性抑制剂的抑制程度取决于S，I，Km和KmI，当I增加，或KI减小，都会使KmI值增大，使酶与底物的结合能力下降，活性复合物减少，因而使底物反应速率下降。若I不变，增加S，抑制程度降低；若S不变，增加I，抑制程度增加。在一定的S和I条件下，KI值越低，抑制程度越大。,55,竞争性抑制的s-r关系图：,56,竞争性抑制的双倒数方程式,或,57,58,又,以KmI对I作图，据此图可求出Km和KI值 .,竞争性抑制的KI与I关系图,59,抑制剂的解离常数 由此可看出，KI愈小，表明抑制剂与酶的结合力愈强，对酶催化反应能力的抑制作用就越强。 当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，KmI与I的关系为一直线，可称为线型竞争抑制；如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相结合，则与的关系为一抛物线，可称为抛物线型竞争抑制。,60,例4-3：在一定的酶浓度、pH和温度条件下，
