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1、第二章 动物细胞培养基本技术与原理,细胞与组织培养（体外培养）(cell and tissue culture)： 从机体中取出组织或细胞，模拟体内生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。 包括三个层面：器官培养、组织培养、细胞培养 分别代表细胞水平、组织水平或器官水平的培养,动物细胞培养的主要领域及意义,动物细胞的培养特性,动物细胞培养的生存条件,主要讲3方面问题：,一、动物细胞培养的主要领域及意义,单克隆抗体与现代医学,动物胚胎孵育与畜牧业,动物细胞培养与现代医药业,动物克隆的广泛应用,1.单克隆抗体技术与现代医学,单克隆抗体技术步骤：* 骨髓瘤细胞(myeloma cell) 特定抗原免
2、疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合 杂交瘤细胞(hybridoma cell)。,杂交瘤细胞的特性：* 既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。 单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology)。,单克隆抗体的特性：* 具有高度的特异性、灵敏性与准确性 应用：临床医学的疾病诊断。 生产各种免疫疫苗。 用于某些肿瘤的治疗。 用于各种基础医学研究。,2.胚胎孵育与畜牧业,农畜动物胚胎移植：利用胚胎技术大批量生产优质胚胎，从而可以 降低胚胎成本，扩大移植胚的来源。 体外受精：加快农畜良
3、种化。利用体外受精技术进行核移 植、性别控制和基因导入，工厂化生产遗传性状稳定、生 产性能优良的家畜。,3.动物细胞规模化培养与现代医药,治疗性抗体,抗体药物,4.动物克隆技术有益应用,动物克隆技术的应用前景： （1）保存优良的动物品种 （2）拯救濒临灭绝的珍惜动物 （3）利用克隆动物工厂生产蛋白质药物 （4）利用克隆技术生产人体器官,二、动物细胞特性,动物细胞在活体内的特性,培养条件下动物细胞生长特性,培养条件下动物细胞生理特性,1. 动物细胞在活体内的特性,在活体内，动物细胞: 分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。 如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神
4、经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。,增殖 分化,活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类： 第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞； 第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞； 第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。 第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。,2. 培养条件下动物细胞的生长特性,离体培
5、养的动物细胞可分为： 贴壁依赖型(anchorage-dependent) 非贴壁依赖型(anchorage-independent) 兼性贴壁细胞,1）贴壁依赖型 简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形性细胞型。 成纤维细胞型 细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭形或不规则三角形，中央有园形核，胞质向外伸出23个长短不同的突起。细胞群常连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤维细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞培养时均属这一类型。,游走细胞型 在支持物上分散生 长，不连接成片，细胞胞质常伸出 伪足或突起，呈活跃的游走和变 形运动，速度快而方向不规则。在 一定条
6、件下，可转变为成纤维细胞 型。 多形性细胞型 某些组织和细胞， 如神经细胞，难以确定它们的稳 定形态，可统归于多形细胞型。,nerve cell,.,18,2）非贴壁依赖型 也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞等均属于此类，细胞一般呈圆形。 3）兼性贴壁细胞 动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。,4. 培养条件下动物细胞的生理特点,1）动物细胞的分裂周期长 动物细胞分裂周期一般为1248小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞
7、所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。,2）接触抑制(contact inhibition)现象 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。,3）有限细胞系和永久细胞系 动物细胞离体培养起始物-原代培养（primary culture） 经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有限细胞系即使培养条件均能满足细
8、胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过3050世代后细胞将逐渐死亡。,“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。,大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformatio
9、n)。 永久细胞系有如下特征： 细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比； 生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小； 贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前体。,4）动物细胞的环境敏感性 动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。 动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。 动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。,三、动物细胞的环境要求,1. 动物细胞培养的环境要求,1）无污染环境 2）温度 昆虫细胞培养
10、温度一般是2528 哺乳动物细胞的培养温度一般是37。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞在45下只能存活1小时，但在25条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。,3）pH 动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。 培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。,4）气体环境及溶氧 一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足
11、，将导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。,5）渗透压 动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题： 培养基的渗透压维持 细胞体内的渗透压维持 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。,四、动物细胞培养,基本概念和基本步骤: 取材分离和组织消化 细胞计数 常用培养法 细胞的常规检查 细胞系与克隆 动物细胞的大规模培养 细胞的冻存与复苏,一、基本概念（general concept）： 细胞培养（cell culture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体
12、内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程。 原代（初代）培养：指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。原代培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。 传代（继代）培养：从原代培养的细胞继续转接培养，称为传代培养。传代培养的细胞称为传代细胞。,二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion ) （一）取材获取组织 原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组
13、织的各种情况进行详细记录； 所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。,取材方法: 处死动物 取出组织块，放入小烧杯中 用尖嘴眼科剪刀 将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎 块，补加35ml Hanks液，用吸管轻轻吹打； 低速离心，弃去上 清液，留下组织块。（也可用手术刀片将组织块切碎，优点：对细 胞损伤较小，缺点是操作时间长，容易污染） 对某些软组织碎 组织块，可放入注射器玻璃管中或1mm不锈钢/尼龙网筛挤压分离。,（二）组织消化(tissue digestion) 用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。 1、常用消化液适用范围 （1）胰蛋白酶：
14、适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾、传代细胞等。 （2）胶原酶：适用于纤维组织、上皮组织、癌组织等。 （3）其他酶：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，根据酶的作用特点及组织成分不同适当选用 （4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。,2、组织消化操作方法(tissue digestion method of operation) （1）胰蛋白酶消化(trypsin digestion) 将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶中，加入3050倍体积的0.25%胰 蛋白酶； 37水浴内消化3060min，每510min摇动一次。根据效果可中间更换消 化液。（静止1
15、0min，吸去2/3上清液，补加新鲜胰蛋白酶） Hanks液漂洗两次，每次23min； 800r/min离心5min，弃上清液，加入营养液。如有大块，可用纱网过滤。 如消化传代细胞，可与EDTA混用。,（2）胶原酶消化(collagenase enzymatic digestion ) 培养瓶中放入15mm3大小的碎组织块，加5ml 2000 u/ml的胶原酶溶液，使终浓度为200u/ml，pH6.5； 36.5水浴2448h，视情况可适当延长，无需摇动。期间可更换酶液一次； 见组织块已变软，分散于瓶底时，轻微震荡使散成细胞团或单细胞。小心倒出培养液，瓶底可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开（
16、单独培养或弃之不用）； 800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再重复离心一次； 加入培养液制成细胞悬液，用于接种。,三、细胞计数(cell counting) 计数悬浮液中细胞的形态及浓度，以判断消化或稀释程度（亦用于培养液中细胞浓度的检查） 染色：在干净的离心管中加入9滴细胞悬液，再加入1滴0.4%台盼蓝，混匀，静置23min； 充池：在计数板盖片边缘加入12滴染色的细胞悬液，使之完全充满计数板与盖玻片间的空间（无气泡或溢出）,计数：在显微镜下记录计数板四角四个大方格中的活细胞（不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞，数上不数下，数左不数右。 计算： 细胞悬液浓度（细胞个数/ml）=（4大格细胞总数/4）104稀释倍数 注意：如细胞团数超过10%，说明消化不充分。 细胞接种浓度：310105/ml,四、常用培养法(general cultivation) （一）组织块培养法( tissue piece cultivation) 将组织块剪切成小块，直接放入培养瓶中，
